Ontwikkeling van een bio-hybride Mosquito Stinger-gebaseerde atoomkrachtmicroscopiesonde

Summary

Kwantitatief en gecontroleerd onderzoek naar het bijtgedrag van insecten is cruciaal voor het bedenken van effectieve strategieën om door vectoren overgedragen ziekten te bestrijden. In deze context wordt een methode geïntroduceerd voor het vervaardigen van een biohybride atoomkrachtmicroscopie (AFM) sonde.

Abstract

Muggen, berucht als de dodelijkste dieren voor de mens vanwege hun vermogen om ziekten over te dragen, vormen een aanhoudende uitdaging voor de volksgezondheid. De primaire preventiestrategie die momenteel wordt gebruikt, omvat chemische insectenwerende middelen, die vaak niet effectief blijken te zijn omdat muggen snel resistentie ontwikkelen. Daarom is de uitvinding van nieuwe preventieve methoden cruciaal. Een dergelijke ontwikkeling hangt af van een grondig begrip van het bijtgedrag van muggen, waardoor een experimentele opstelling nodig is die de werkelijke bijtscenario’s nauwkeurig repliceert met controleerbare testparameters en kwantitatieve metingen. Om deze kloof te overbruggen, werd een bio-hybride atoomkrachtmicroscopie (AFM) sonde ontworpen, met een biologische angel – in het bijzonder, een mug labrum – als punt. Deze bio-hybride sonde, compatibel met standaard AFM-systemen, maakt een bijna-authentieke simulatie van het gedrag van de muggenpenetratie mogelijk. Deze methode markeert een stap voorwaarts in de kwantitatieve studie van bijtmechanismen, wat mogelijk kan leiden tot het creëren van effectieve barrières tegen door vectoren overgedragen ziekten (VBD’s) en het openen van nieuwe wegen in de strijd tegen door muggen overgedragen ziekten.

Introduction

De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) meldde dat door vectoren overgedragen ziekten (VBD’s) verantwoordelijk zijn voor meer dan 17% van alle infectieziekten, die wereldwijd meer dan 7,00,000 doden per jaar veroorzaken. Als dodelijkste dier ter wereld verspreiden muggen bijvoorbeeld tal van ziekteverwekkers, zoals dengue, malaria en zika, via bloedvoedende geleedpotigen, wat resulteert in 700 miljoen infecties per jaar¹. Verkenningen in de richting van de ontwikkeling van effectieve maatregelen om VBD’s te voorkomen zijn van cruciaal belang, waaronder het nabootsen van het penetratiegedrag van muggen om hun bijtmechanismen te onderzoeken en studies van mogelijke barrières om hun werkzaamheid bij het voorkomen van penetratie te bewijzen. Een belangrijke uitdaging is het ontwikkelen van de juiste aanpak om dergelijke onderzoeken uit te voeren. Er zijn inspanningen geleverd in de literatuur, waaronder de ontwikkeling van naalden op microschaal die lijken op de geometrie van een muggenangel; veel van de materialen die worden gebruikt om deze micronaalden te maken (d.w.z. visco-elastische materialen², silicium (Si), glas, keramiek³, enz.) hebben echter andere mechanische eigenschappen dan het biologische materiaal van de slurf van de mug. De technische materialen kunnen broos zijn en vatbaar voor breuk en knikken ^3,4, terwijl de slurf van de mug beter bestand is tegen breuk of knikken⁴. Het voordeel van het hebben van een bio-hybride sonde die het labrum van een mug gebruikt in plaats van technische materialen, is dat het een nauwkeurigere weergave kan zijn van het doorboormechanisme van muggen. Ook moeten gespecialiseerde gereedschappen worden geïntegreerd met micronaalden om kwantitatieve studies uit te voeren, zoals de nauwkeurige meting van kracht⁵, wat niet gemakkelijk te bereiken is met op maat gemaakte opstellingen met behulp van technische micronaalden.

Atoomkrachtmicroscopie (AFM) gebaseerde benadering is veelbelovend in die zin dat het werkt door gebruik te maken van een cantilever met een ultrafijne punt die zorgvuldig dicht bij het oppervlak van een monster wordt geplaatst. De punt kan over een oppervlak scannen of ernaar/in worden gedrukt, waarbij verschillende aantrekkende of afstotende krachten worden ervaren als gevolg van de interacties met een monster⁶. Deze interacties leiden tot de afbuiging van de uitkraging, die wordt gevolgd door de weerkaatsing van een laserstraal vanaf de bovenkant van de uitkraging op een fotodetector⁶. De uitzonderlijke gevoeligheid voor beweging van het systeem stelt AFM in staat om een breed scala aan metingen uit te voeren, met inbegrip van maar niet beperkt tot morfologische kartering met picometernauwkeurigheid, krachtmetingen variërend van piconewton tot micronewton, en uitgebreide multifysische onderzoeken⁷. Bijvoorbeeld, AFM-inkepingen kunnen worden uitgevoerd om de reactie op de uitgeoefende kracht van een monster nauwkeurig te beoordelen en ook om de hardheid, elasticiteit en andere mechanische eigenschappen van een monster te meten door koppeling met geschikte analytische modellen⁸. De sonde van AFM wordt meestal gemaakt van silicium (Si) of siliciumnitride (Si₃N₄)⁸ met een lengte van 20-300 μm⁹ en een eindstraal in de orde van enkele tot tientallen nanometers¹⁰. De tipradius van de nanometerschaal kan ideaal zijn voor toepassingen zoals beeldvorming met hoge resolutie; Het heeft echter niet de kenmerken van biologische stingers voor studies die penetratiegedrag proberen na te bootsen in termen van stijfheid, straal, vorm en beeldverhouding. De micronaaldstructuur van een mug is bijvoorbeeld de fascikel, die een beeldverhouding heeft van ~60¹¹ (lengte ~1,5 mm tot 2 mm; diameter ~30 μm)¹². Hoewel een conventionele AFM-sonde kan worden verondersteld te lijken op een biologische angel zoals een labrum, zullen de verschillende materiaaleigenschappen en afmetingen niet de werkelijke situatie tijdens een beet weerspiegelen.

Om kwantitatief onderzoek van penetratiegedrag mogelijk te maken dat biologische beten van insecten of andere dieren met stingers nabootst, hier, een proces om bio-hybride AFM-cantilevers met een biologische stinger te fabriceren terwijl zijn uiteinde wordt ontwikkeld. Als casestudy werd met succes een AFM-uitkraging gedemonstreerd met de punt van een muggenlabrum eraan. Gebruikmakend van bestaande informatie uit de literatuur over de typische invoegkrachten die een mug gebruikt om door de huid van een slachtoffer te doorboren^12,13, kan deze bio-hybride AFM-cantilever mogelijk bijna-echte nabootsing van muggenbeten onder een regelmatige AFM mogelijk maken. Het protocol van het hefboomgebruik van micro- biologische stingers om bio-hybride AFM-cantilevers te fabriceren kan ook aan de ontwikkeling van andere scherpe stinger-gebaseerde biohybride AFM-cantilevers voor kwantitatief onderzoek van een verscheidenheid van het bijten mechanismen worden toegepast.

Terminologieën
Een schema van een proboscis en zijn componenten van belang worden weergegeven in figuur 1, en hun definities zijn (1) Proboscis: een lichaamsdeel uit de mond van een mug dat de mug in staat stelt zichzelf te voeden, met een kern-schaalstructuur bestaande uit de fascikel (kern) en het labium (schaal), (2) Labium: de donkere en stompe buitenkant van een proboscis², (3) Fascikel: een groep slanke naalden in het labium, waaronder twee bovenkaakjes, twee onderkaken, een hypofarynx en een labrum², (4) Hypofarynx: verantwoordelijk voor het afscheiden van speeksel in de bloedbaan van de gastheer², (5) Maxillae: gekarteld lid dat helpt bij het voedingsmechanisme², (5) Onderkaken: vergelijkbaar met de bovenkaak, helpen ze de mug bij het voedingsmechanisme en hebben ze een scherpe punt², (6) Labrum: het belangrijkste lid om de huid van een slachtoffer binnen te dringen, dat veel groter is dan de bovenkaak, onderkaken en hypofarynx. Het heeft ook sensorische structuren die het mogelijk maken om bloedvaten en interne kanalen onder de huid te vinden², (7) Manipulator: een assemblage met drie vrijheidsgraden en nauwkeurigheid op micronschaal voor positionering, waardoor beweging in XYZ-richtingen mogelijk is, (8) Clamp-assemblage: een op maat gemaakte 2-delige klem gemonteerd op de manipulator die wordt gebruikt om de tiploze AFM-cantilever tijdens het experiment vast te klemmen.

Protocol

De muggensoort die voor dit protocol wordt gebruikt, is een niet-geïnfecteerde volwassen vrouwtje Aedes aegypti (A. aegypti), ingevroren ontvangen en bewaard in een vriezer van -20 °C. De soort werd geleverd door het NIH/NIAID Filariasis Research Reagent Resource Center voor distributie via BEI Resources, NIAID, NIH: Uninfected Aedes aegypti, Strain Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920. De reagentia en apparatuur die voor het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltab…

Representative Results

De beelden van de scanningelektronenmicroscopie (SEM) van de vervaardigde bio-hybride AFM-sonde kunnen in Figuur 7 worden gevonden. Het uiteinde van het labrum werd met succes vastgelijmd aan de uitkragende balk. Vanwege de natuurlijke kromming van muggensteken en de handmatige bediening van het gepresenteerde protocol, is het uiterst moeilijk om een uitkraging te verkrijgen met een steekpunt die perfect loodrecht op de uitkraging staat. De niet-gecentreerde hoek tussen de angel en een denkb…

Discussion

Stap 1 van het protocol is bedoeld om het biologische monster te reinigen van het ongewenste labium. Om dit te bereiken wordt een incisie gemaakt op het labium, maar niet op de fascikel, die direct onder het labium rust (Figuur 1). Omdat de fascikel en het labium niet aan hun grensvlak met elkaar zijn verbonden (d.w.z. het labium kan vrij langs de fascikel glijden en wordt alleen op zijn plaats gehouden door zijn bevestiging aan de muggenkop), is de uitgevoerde incisie bedoeld om een deel va…

Materials

5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers	Excelta	N/A	For manipulating/dissecting the proboscis.
C-4D Probe station	Everbeing Int’l Corp	N/A	Used for AFM assembly.
Tipless Tapping Mode Cantilever	NanoAndMore USA	TL-NCH	AFM cantilever used for mounting the labrum. Specs are shown here: Shape: Beam Force Constant: 42 N/m (10 – 130 N/m) Resonance Frequency: 330 kHz (204 – 497 kHz) Length: 125 µm (115 – 135 µm) Breite: 30 µm (22.5 – 37.5 µm) Thickness: 4 µm ( 3 – 5 µm)
UV Expoxy	Let's resin	ALR00146	For stinger attachment.