Biyo-Hibrit Sivrisinek Stinger Tabanlı Atomik Kuvvet Mikroskobu Probunun Geliştirilmesi
Summary
Böcek ısırma davranışlarına yönelik nicel ve kontrollü araştırmalar, vektör kaynaklı hastalıklarla mücadelede etkili stratejiler geliştirmek için çok önemlidir. Bu bağlamda, bir biyo-hibrit atomik kuvvet mikroskobu (AFM) probu üretmek için bir yöntem tanıtılmaktadır.
Abstract
Hastalık bulaştırma kapasiteleri nedeniyle insanlar için en ölümcül hayvanlar olarak ün salmış sivrisinekler, halk sağlığı için kalıcı bir sorun teşkil etmektedir. Şu anda kullanımda olan birincil önleme stratejisi, sivrisinekler hızla direnç geliştirdikçe genellikle etkisiz olduğu kanıtlanan kimyasal kovucuları içerir. Sonuç olarak, yeni önleyici yöntemlerin icadı çok önemlidir. Bu tür bir gelişme, sivrisinek ısırma davranışlarının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına dayanır ve kontrol edilebilir test parametreleri ve nicel ölçümlerle gerçek ısırma senaryolarını doğru bir şekilde kopyalayan deneysel bir kurulum gerektirir. Bu boşluğu doldurmak için, ucu olarak biyolojik bir iğne – özellikle bir sivrisinek labrumu – içeren bir biyo-hibrit atomik kuvvet mikroskobu (AFM) probu tasarlandı. Standart AFM sistemleriyle uyumlu olan bu biyo-hibrit prob, sivrisinek penetrasyon davranışlarının neredeyse otantik bir simülasyonunu sağlar. Bu yöntem, ısırma mekanizmalarının kantitatif çalışmasında ileriye doğru atılmış bir adımdır ve potansiyel olarak vektör kaynaklı hastalıklara (VBD’ler) karşı etkili bariyerlerin oluşturulmasına ve sivrisineklerle bulaşan hastalıklara karşı mücadelede yeni yollar açılmasına yol açar.
Introduction
Dünya Sağlık Örgütü (WHO), vektör kaynaklı hastalıkların (VBD’ler) tüm bulaşıcı hastalıkların %17’sinden fazlasını oluşturduğunu ve dünya çapında yılda 7.000.000’den fazla ölüme neden olduğunu bildirmiştir. Örneğin, dünyanın en ölümcül hayvanı olan sivrisinekler, kanla beslenen eklembacaklılar yoluyla dang humması, sıtma ve Zika gibi çok sayıda patojeni yayarak her yıl 700 milyon enfeksiyona neden olur1. Sivrisineklerin ısırma mekanizmalarını araştırmak için penetrasyon davranışlarını taklit etmek ve penetrasyonu önlemedeki etkinliklerini kanıtlamak için potansiyel engellerin incelenmesi de dahil olmak üzere, VBD’leri önlemek için etkili önlemlerin geliştirilmesine yönelik araştırmalar çok önemlidir. Önemli zorluklardan biri, bu tür araştırmaları gerçekleştirmek için uygun yaklaşımlar geliştirmektir. Literatürde, bir sivrisinek iğnesinin geometrisine benzeyen mikro ölçekli iğnelerin geliştirilmesi de dahil olmak üzere çabalar sarf edilmiştir; bununla birlikte, bu mikro iğneleri yapmak için kullanılan malzemelerin çoğu (yani, viskoelastik malzemeler2, silikon (Si), cam, seramik3, vb.), sivrisinek hortumunun biyolojik malzemesinden farklı mekanik özelliklere sahiptir. Mühendislik malzemeleri kırılgan olabilir ve kırılmaya ve burkulmayaeğilimli olabilir 3,4, oysa sivrisineğin hortumu kırılmaya veya burkulmaya daha iyi dayanabilir4. Mühendislik malzemeleri yerine bir sivrisineğin labrumunu kullanan biyo-hibrit bir proba sahip olmanın yararı, sivrisineklerin delici mekanizmasının daha doğru bir temsili olabilmesidir. Ayrıca, mühendislik ürünü mikro iğneler kullanılarak özelleştirilmiş kurulumlarla kolayca elde edilemeyen5 kuvvetinin doğru ölçümü gibi nicel çalışmaları gerçekleştirmek için özel aletler mikro iğnelerle entegre edilmelidir.
Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) tabanlı yaklaşım, bir numunenin yüzeyine dikkatlice yerleştirilmiş ultra ince uçlu bir konsol kullanarak çalışması açısından umut vericidir. Uç, bir numune6 ile etkileşimleri nedeniyle değişen çekici veya itici kuvvetlere maruz kalarak bir yüzeyi tarayabilir veya bir yüzeye doğru / içine bastırılabilir. Bu etkileşimler, konsolun üst kısmından bir lazer ışınının bir fotodetektöre6 yansımasıyla izlenen konsolun sapmasına yol açar. Sistemin hareketine karşı olağanüstü hassasiyeti, AFM’nin pikometre doğruluğu ile morfolojik haritalama, pikonewtonlardan mikronewtonlara kadar değişen kuvvet ölçümleri ve kapsamlı multifizik araştırmaları dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çok çeşitli ölçümler yapmasını sağlar7. Örneğin, bir numunenin uygulanan kuvvete tepkisini hassas bir şekilde değerlendirmek ve ayrıca uygun analitik modellerle birleştirilerek bir numunenin sertliğini, elastikiyetini ve diğer mekanik özelliklerini ölçmek için AFM girintileri yapılabilir8. AFM’nin probu en yaygın olarak silikon (Si) veya silisyum nitrürden (Si3N4) yapılır.8 20-300 μm9 uzunluğunda ve birkaç ila onlarca nanometre10 mertebesinde bir uç yarıçapı. Nanometre ölçeği uç yarıçapı, yüksek çözünürlüklü görüntüleme gibi uygulamalar için ideal olabilir; Bununla birlikte, sertlik, yarıçap, şekil ve en boy oranı açısından penetrasyon davranışlarını taklit etmeye çalışan çalışmalar için biyolojik iğnelerin özelliklerine sahip değildir. Örneğin, bir sivrisineğin mikroiğne yapısı, ~6011 (uzunluk ~ 1,5 mm ila 2 mm; çap ~ 30 μm) en boy oranına sahip fasiküldür12. Konvansiyonel bir AFM probunun bir labrum gibi biyolojik bir iğneye benzediği varsayılabilirken, farklı malzeme özellikleri ve boyutları, bir ısırma sırasındaki gerçek durumu yansıtmayacaktır.
Böceklerin veya iğneli diğer hayvanların biyolojik ısırıklarını taklit eden penetrasyon davranışlarının nicel araştırmalarını mümkün kılmak için, burada, ucu biyolojik bir iğne olan biyo-hibrit AFM konsolları üretmek için bir süreç geliştirilmiştir. Bir vaka çalışması olarak, bir sivrisinek labrumunun ucu takılı bir AFM konsolu başarıyla gösterildi. Bir sivrisineğin kurbanın derisini delmek için kullandığı tipik yerleştirme kuvvetleri12,13 hakkındaki literatürdeki mevcut bilgilerden yararlanan bu biyo-hibrit AFM konsolu, normal bir AFM altında sivrisinek ısırıklarının neredeyse gerçek taklidine potansiyel olarak izin verebilir. Biyo-hibrit AFM konsollarını imal etmek için mikro biyolojik iğnelerden yararlanma protokolü, çeşitli ısırma mekanizmalarının kantitatif araştırmaları için diğer keskin stinger bazlı biyohibrit AFM konsollarının geliştirilmesine de uygulanabilir.
Terminoloji
Bir hortumun şeması ve ilgilenilen bileşenleri Şekil 1’de gösterilmiştir ve tanımları şöyledir: (1) Hortum: Bir sivrisineğin ağzından çıkan ve sivrisineğin kendi kendini beslemesine izin veren, fasikül (çekirdek) ve labiumdan (kabuk) oluşan bir çekirdek-kabuk yapısına sahip bir vücut parçası, (2) Labium: bir hortumun koyu ve künt dış örtüsü2, (3) Fasikül: iki maksilla, iki mandibula, bir hipofarenks ve bir labrum2 dahil olmak üzere labiumun içinde bulunan bir grup ince iğne, (4) Hipofarenks: konakçının kan dolaşımına tükürük salgılamaktan sorumludur2, (5) Maksilla: beslenme mekanizmasına yardımcı tırtıklı üye2, (5) Mandibulalar: maksillaya benzer şekilde, sivrisineğe beslenme mekanizmasında yardımcı olurlar ve keskin bir uca sahiptirler2, (6) Labrum: maksilla, mandibula ve hipofarenksten çok daha büyük olan bir kurbanın derisine nüfuz etmek için ana üye. Ayrıca deri altındaki kan damarlarını ve iç kanalları bulmasını sağlayan duyusal yapılara sahiptir2, (7) Manipülatör: XYZ yönlerinde harekete izin veren, konumlandırma için üç serbestlik derecesine ve mikron ölçeğinde doğruluğa sahip bir düzenek, (8) Kelepçe düzeneği: deney sırasında uçsuz AFM konsolunu sıkıştırmak için kullanılan manipülatöre monte edilmiş özel yapım 2 parçalı bir kelepçe.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokolün 1. adımı, istenmeyen labiumun biyolojik örneğini temizlemek içindir. Bunu başarmak için labium üzerinde bir kesi yapılır, ancak doğrudan labiumun altında duran fasikül üzerinde bir kesi yapılmaz (Şekil 1). Fasikül ve labium arayüzlerinde birleştirilmediğinden (yani, labium fasikül boyunca serbestçe kayabilir ve sadece sivrisinek kafasına bağlanmasıyla yerinde tutulur), yapılan kesi, labiumun bir kısmını sivrisinek kafasından ayırmak ve böylece dı?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Kanada’nın New Frontiers in Research Fund (NFRF), Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Keşif programı ve Fonds de Recherche du Québec Nature et Technologies (FRQNT) yüksek lisans eğitim burslarından sağlanan finansman desteğini kabul etmektedir. Yazarlar ayrıca, bazı bileşenlerin 3D baskısı konusundaki teknik destekleri için Prof. Yaoyao Zhao’nun McGill’deki grubuna teşekkür etmek istiyor.
Materials
| 5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers | Excelta | N/A | For manipulating/dissecting the proboscis. |
| C-4D Probe station | Everbeing Int’l Corp | N/A | Used for AFM assembly. |
| Tipless Tapping Mode Cantilever | NanoAndMore USA | TL-NCH | AFM cantilever used for mounting the labrum. Specs are shown here: Shape: Beam Force Constant: 42 N/m (10 – 130 N/m) Resonance Frequency: 330 kHz (204 – 497 kHz) Length: 125 µm (115 – 135 µm) Breite: 30 µm (22.5 – 37.5 µm) Thickness: 4 µm ( 3 – 5 µm) |
| UV Expoxy | Let's resin | ALR00146 | For stinger attachment. |
Referenzen
- World Health Organization. Global vector control response 2017–2030. World Health Organization. , (2017).
- Gurera, D., Bhushan, B., Kumar, N. Lessons from mosquitoes’ painless piercing. J Mech Behav Biomed Mater. 84, 178-187 (2018).
- Ma, G., Wu, C. Microneedle, bio-microneedle and bio-inspired microneedle: A review. Journ of Contr Relea. 251, 11-23 (2017).
- Kong, X., Wu, C. Micronano structure and mechanics behavior of mosquito’s proboscis biomaterials with applications to microneedle design. Advan Mater Res. 299-300, 376-379 (2011).
- Li, A. D. R., Putra, K. B., Chen, L., Montgomery, J. S., Shih, A. Mosquito proboscis-inspired needle insertion to reduce tissue deformation and organ displacement. Sci Rep. 10 (1), 12248 (2020).
- Meyer, E., Hug, H. J., Bennewitz, R. Introduction to Scanning Probe Microscopy. Scanning Probe Microscopy. 1, 1-13 (2004).
- García, R., Peréz, R. Dynamic atomic force microscopy methods. Surf Sci Rep. 47 (6), 197-301 (2002).
- Thurner, P. J. Atomic force microscopy and indentation force measurement of bone. WIREs Nanomed and Nanobio. 1 (6), 624-649 (2009).
- Müller, D. J., Dufrêne, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nat Nanotech. 3 (5), 261-269 (2008).
- Hussain, D., Ahmad, K., Song, J., Xie, H. Advances in the atomic force microscopy for -critical dimension metrology. Meas Sci Technol. 28 (1), 012001 (2017).
- Kong, X. Q., Wu, C. W. Mosquito proboscis: An elegant biomicroelectromechanical system. Phys Rev E. 82 (1), 011910 (2010).
- Kong, X. Q., Wu, C. W. Measurement and prediction of insertion force for the mosquito. J Bionic Eng. 6 (2), 143-152 (2009).
- Ramasubramanian, M. K., Barham, O. M., Swaminathan, V. Mechanics of a mosquito bite with applications to microneedle design. Bioinspir Biomim. 3 (4), 046001 (2008).
- Dai, G., et al. Nanoscale surface measurements at sidewalls of nano- and micro-structures. Measur Sci and Technol. 18 (2), 334-341 (2007).
