Encyclopedia of Experiments: Biology
Ein Abonnement für JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt ansehen zu können. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Cardiomyopathie is een aandoening waarbij de hartspier verzwakt en het vermogen verliest om bloed te pompen. Deze aandoening kan worden gerepliceerd in zebravissen. Verdun eerst een stamoplossing van een medicijn dat verantwoordelijk is voor cardiotoxiciteit in Hanks' Balanced Salt Solution om verschillende werkconcentraties voor te bereiden. Plaats vervolgens een tricaïne-verdoofde vis, ventrale kant naar boven, op een spons onder een ontleedmicroscoop. Plaats de naald tussen de bekkenvinnen onder een hoek van 45 graden horizontaal.
Duw nu voorzichtig de naald 1 tot 2 millimeter in de buikholte en injecteer langzaam de medicijnoplossing. Wacht vijf seconden voordat u de naald eruit trekt om te voorkomen dat de oplossing uitlekt. Breng de vis onmiddellijk over naar een schone tank met vers systeemwater. Registreer het aantal vissen dat elke dag sterft als gevolg van ernstige cardiotoxiciteit, schade aan de hartspier. Het medicijn bindt zich aan doodsreceptoren die aanwezig zijn op het cardiomyocytcelmembraan en veroorzaakt apoptose, wat resulteert in ernstige cardiotoxiciteit.
Maak een overlevingscurve, een grafiek die de overlevingskans in de loop van de tijd weergeeft voor elke medicijnconcentratie. In het voorbeeld zullen we doxorubicine, of DOX, injecteren om cardiomyopathie op twee manieren bij een volwassen zebravis te induceren.
Voordat u de vis met DOX injecteert, moet u de vis 24 uur vastzetten. Groepeer vervolgens de vis. Gebruik onder narcose een schoon filterpapier om elke vis te drogen en het lichaamsgewicht te meten. Maak groepen vissen die allemaal binnen 10% van hetzelfde lichaamsgewicht liggen, zodat elke groep met dezelfde dosis DOX kan worden geïnjecteerd. Bereken vervolgens de werkconcentratie van DOX voor elke groep, zodat elke groep wordt geïnjecteerd met vijf microliter oplossing en dezelfde dosis dox krijgt.
Verdun vervolgens de kolf van DOX in 1x HBSS. Meng de verdunning met een vortex en pulseer vervolgens de verdunning om deze samen in de buis te houden. Bereid voor de injectie een injectieplatform voor. Plaats in een schone petrischaal van 100 millimeter een spons. Snijd met behulp van een dissectiemicroscoop een holte in de spons om één vis vast te houden, vier centimeter werkt meestal.
Vervolgens, op een 34-gauge naald, bevestig een 10-microliter microsyringe. Spoel vervolgens de naald met 1x HBSS om eventuele bubbels of blokken uit de spuit en slang te verwijderen. Nu, verdoof de volwassen vis kort met tricaine. Week vervolgens de spons in het embryowater met tricaine en breng een vis over op de spons met zijn buik omhoog voor de injectie. Injecteer nu intraperitoneaal DOX-oplossing door snel de naald in te brengen.
Laat vervolgens langzaam alle DOX-oplossing los. Wacht voordat u de naald intrekt vijf seconden. Als alternatief kan de vis lateraal worden geplaatst met het binnenste naar rechts. Injecteer vervolgens de laterale lijn boven de bekkenvin met de schuine kant omhoog gericht naar 7 uur onder een hoek van 45 graden en 3 tot 4 millimeter diep. Als een van beide injectiemethodes succesvol was, zal er een rode tint in de buik zijn.
Breng de vis na de injectie snel over naar een schone oversteektank gevuld met vers systeemwater waar hij zich kan herstellen. Spoel vervolgens de naald af met HBSS en ga verder met het injecteren van de volgende vis. Breng de geïnjecteerde vis later terug naar een systeem met lopende circulatie, maar gescheiden van het hoofdsysteem om kruisbesmetting te voorkomen. Blijf de vis de komende 24 uur vasten. Controleer de vis de eerste week na de injectie dagelijks en verwijder dode vissen.
