3D-cocultuur met directe interactie: kankercellen co-cultiveren met monocyten om hun interactie te bestuderen

Voeg om te beginnen DQ collageen IV, een fluorescerende kleurstof gedoofd eiwitsubstraat toe aan een extracellulair matrixextract of ECME. Giet dit extract in elke put van een dia met twee putten. Label de eerste evenals co-cultuur, tweede als controle. Voeg een geschikte hoeveelheid fluorescerend gelabelde kankercelsuspensie toe aan putten en incubeer de dia op 37 graden Celsius gedurende de gewenste tijd om de celaanhechting te bevorderen.

Voeg een vereiste hoeveelheid monocytencelsuspensie toe aan de eerste put. Laat de ECME stollen bij 37 graden Celsius. Giet gelijke verhoudingen van kankercel- en monocytcultuurmedia in elke put en incubeer de dia op 37 graden Celsius voor de gewenste duur in een kooldioxideomgeving. In de co-cultuur goed scheiden kankercellen eiwitten zoals monocyten chemoattractant eiwit af om monocyten aan te trekken.

Monocyten produceren daarentegen matrix metalloproteinase of MMP, om het collageen af te afgebroken, wat de invasie van kankercellen bevordert. Observeer de dia onder een confocale microscoop. De DQ collageenafbraak zendt fluorescentie uit die meer te zien is in de co-cultuurcellen die wijzen op celinteractie, terwijl minder in controlecellen. In het volgende protocol zullen we borstkankercellen co-kweeken met monocyten om hun interactie te bestuderen.

Om BRC-cellen en monocyten te labelen met in de handel verkrijgbaar cumarine en rhodamine vóór celkweek, bereidt u een monolaag van twee keer 10 voor op de zes BRC-cellen van belang en vervangt u het standaardmedium door voldoende voorverwarmde werkoplossing van de fluorescerende kleurstof. Incubeer de cellen op 37 graden Celsius in een bevochtigde 5% kooldioxide omgeving gedurende 30 minuten. Aspireer vervolgens de kleurstofoplossing en gebruik voldoende 1x PBS om de cellen voorzichtig te spoelen.

Aspireer de PBS en voeg het standaard medium toe. Om de cellen te trypsiniseren, voegt u twee milliliter 0,05% trypsine en 0,48 millimol EDTA toe aan de kolf en incubeert u de cellen gedurende 5 tot 10 minuten op 37 graden Celsius. Voeg 200 microliter FBS toe om de trypsinisatie te stoppen en zeven milliliter van het overeenkomstige medium zonder supplementen.

Resuspendeer de cellen door pipetten, breng vervolgens 10 microliters van de cellen over naar een Neubauer-kamer en tel ze. Pellet vervolgens de cellen op 430 x g bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten, gooi vervolgens het supernatant weg en gebruik milliliter voorverwarmde fluorescerende kleurstof om de cellen op te schorten.

Incubeer de cellen suspensie bij 37 graden Celsius in een bevochtigde 5% kooldioxide omgeving gedurende 30 minuten. Nadat u de cellen opnieuw hebt geplet, gooit u de kleurstofbewerkingsoplossing weg en gebruikt u 5 tot 7 milliliter 1x PBS om de cellen voorzichtig te resuspenderen. Nadat de cellen opnieuw waren geplet en de PBS waren weggegooid, werden de cellen in 5 tot 7 milliliter standaardmedium geresuspendeerd.

Tel 10 microliters van de celsuspensie. Stel een co-cultuur in door voldoende ECME aan de onderkant van de put te verspreiden om een gelijkmatige laag te vormen in elke put van een vier-put kamerschuifsysteem. Plaat 20 microliters van een eencellige suspensie met 5 keer 10 tot de vijfde gelabelde BRC-cellen per put. Voeg na 15 tot 20 minuten bij 37 graden Celsius een suspensie van 2,5 keer 10 toe aan de vijfde gelabelde monocyten in 80 microliter testmedium, aangevuld met 60% ECME.

Laat de ECME gedurende 15 tot 20 minuten een 37 graden Celsius stollen. Voeg nu 1 milliliter van een 1:1 mengsel van de BRC-cellen en monocytkweekmedium toe. Incubeer de coculturen bij 37 graden Celsius in een bevochtigde koolstofdioxideomgeving van 5% gedurende 24 uur, 48 uur of vijf dagen om veranderingen op verschillende tijdstippen bij te houden.

Om de ECM-eiwitten af te afgebroken en de cellen uit de culturen terug te winnen, aspireert en gooit u het medium weg en voegt u vervolgens 0,5 milliliter 1x PBS met 0,1% trypsine en 0,25% EDTA toe aan de cultuur. Incubeer de cellen drie uur lang op 37 graden Celsius. Voeg na de incubatie 0,5 milliliter 1x PBS met 10% FBS toe om de trypsine te neutraliseren en de cellen te resuspenderen door krachtig te pipetten om een enkele celsuspensie te verkrijgen.

Gooi na het pelleten van de cellen het supernatant weg en resuspendeerde de cellen in vijf milliliter 1x PBS met 10% FBS. Herhaal de stap één keer. Onderwerp de celsuspensie aan FACS met het juiste instrument. Zorg ervoor dat de uiteindelijke populaties voor minstens 95% zuiver zijn.