Co-culture 3D avec interaction directe : co-culture des cellules cancéreuses avec les monocytes pour étudier leur interaction

Pour commencer, ajouter le collagène DQ IV, un substrat protéique trempé de colorant fluorescent dans un extrait de matrice extracellulaire ou ECME. Verser cet extrait dans chaque puits d’une glissade de deux puits. Étiquetez le premier ainsi que la co-culture, le second comme le contrôle. Ajouter une quantité appropriée de suspension de cellules cancéreuses étiquetées fluorescentes dans les puits, et incuber la toboggan à 37 degrés Celsius pour le temps désiré pour promouvoir l’attachement cellulaire.

Ajouter une quantité requise de suspension cellulaire des monocytes au premier puits. Que l’ECME se solidifie à 37 degrés Celsius. Verser des ratios égaux de cellules cancéreuses et de monocytes dans chaque puits et incuber la glissade à 37 degrés Celsius pendant la durée désirée dans un environnement de dioxyde de carbone. Dans le puits de co-culture, les cellules cancéreuses sécrètent des protéines telles que les monocytes protéine chimioattractante pour attirer les monocytes.

En revanche, les monocytes produisent la métalloprotéine de matrice ou MMP, pour dégrader le collagène, favorisant l’invasion de cellules cancéreuses. Observez la diapositive au microscope confocal. La dégradation du collagène DQ émet une fluorescence qui peut être vu plus dans les cellules de co-culture indiquant l’interaction cellulaire, tandis que moins dans les cellules de contrôle. Dans le protocole suivant, nous co-culture des cellules cancéreuses du sein avec des monocytes pour étudier leur interaction.

Pour étiqueter les cellules brc et les monocytes avec de la coumarine et de la rhodamine disponibles dans le commerce avant la culture cellulaire, préparez un monocouche de deux fois 10 aux six cellules BRC d’intérêt et remplacez le milieu standard par une solution de travail préchauffée suffisante du colorant fluorescent. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un environnement humidifié de dioxyde de carbone de 5% pendant 30 minutes. Ensuite, aspirez la solution de colorant et utilisez suffisamment de 1x PBS pour rincer doucement les cellules.

Aspirer le PBS et ajouter le support standard. Pour trypsiniser les cellules ajouter deux millilitres de trypsine de 0,05% et 0,48 millimolaire EDTA à la fiole, et incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 5 à 10 minutes. Ajouter 200 microlitres de FBS pour arrêter la trypsinisation et sept millilitres du milieu correspondant sans suppléments.

Resuspendez les cellules par pipetting, puis transférez 10 microlitres des cellules à une chambre de Neubauer et comptez-les. Ensuite, pelleter les cellules à 430 x g à température ambiante pendant cinq minutes, puis jeter le supernatant et utiliser des millilitres de teinture fluorescente préchaurée solution de travail pour suspendre les cellules.

Incuber la suspension des cellules à 37 degrés Celsius dans un environnement humidifié de dioxyde de carbone de 5% pendant 30 minutes. Après avoir granulé les cellules à nouveau, jeter la solution de travail colorant et utiliser 5 à 7 millilitres de 1x PBS pour résuspendre doucement les cellules. Puis, après avoir granulé les cellules une fois de plus et jeté le PBS, réutilisé les cellules en 5 à 7 millilitres de milieu standard.

Comptez 10 microlitres de la suspension cellulaire. Mettre en place une co-culture en répartissant suffisamment d’ECME au fond du puits pour former une couche uniforme dans chaque puits d’un système de glissière de chambre à quatre puits. Plaque 20 microlitres d’une suspension à cellule unique contenant 5 fois 10 à la cinquième cellule BRC étiquetée par puits. Après 15 à 20 minutes à 37 degrés Celsius, ajouter une suspension de 2,5 fois 10 aux cinquièmes monocytes étiquetés dans 80 microlitres de milieu d’essai, complétée par 60% d’ECME.

Laissez l’ECME solidifier un 37 degrés Celsius pendant 15 à 20 minutes. Maintenant, ajoutez 1 millilitre d’un mélange 1:1 des cellules brc et du milieu de culture de monocyte. Incuber les co-cultures à 37 degrés Celsius dans un environnement humidifié de dioxyde de carbone de 5 % pendant 24 heures, 48 heures ou cinq jours pour suivre les changements à différents moments.

Pour dégrader les protéines ECM et récupérer les cellules des cultures, aspirer et jeter le milieu puis ajouter 0,5 millilitres de 1x PBS avec 0,1% trypsine et 0,25% EDTA à la culture. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Après l’incubation, ajouter 0,5 millilitres de 1x PBS avec 10% de FBS pour neutraliser la trypsine et résuspendre les cellules en pipetting vigoureusement pour obtenir une suspension à cellule unique.

Après avoir granulé les cellules, jeter le supernatant et réutilisé les cellules en cinq millilitres de 1x PBS avec 10% FBS. Répétez l’étape une fois. Soumettons la suspension cellulaire au FACS avec l’instrument approprié. Assurez-vous que les populations finales sont au moins 95% pures.