قياس معدلات بلازما بروتين الغشاء التقامي بواسطة Biotinylation عكسية
Summary
الإلتقام ينظم ينظم مستويات التعبير سطح الخلية لمعظم البروتينات الغشاء. هنا نستخدم اختزال والكواشف غشاء biotinylation impermeant لقياس معدل التقامي للنقل الدوبامين (DAT) ، وهو بروتين الغشاء polytopic. الأسلوب يسهل نهج مباشرة لقياس معدل التقامي معظم البروتينات غشاء البلازما.
Abstract
بروتينات غشاء البلازما هي كبيرة ، مجموعة متنوعة من البروتينات تتكون من المستقبلات ، وقنوات ايون وشركات النقل والمضخات. نشاط هذه البروتينات هي المسؤولة عن مجموعة متنوعة من الأحداث الخلوية الأساسية ، بما في ذلك تسليم المواد الغذائية ، واستثارة الخلوية ، وإشارات كيميائية. ويتم تنظيم العديد من البروتينات بشكل حيوي غشاء البلازما من الاتجار التقامي ، الذي ينظم وظيفة البروتين البروتين التعبير عن طريق تغيير السطح. الآليات التي تسهل الإلتقام البروتين معقدة وغير مفهومة تماما عن بروتينات غشاء كثيرة. لكي نفهم تماما الآليات التي تتحكم في الاتجار التقامي من بروتين معين ، فمن الأهمية بمكان أن يتم قياسها بدقة نسبة البروتين التقامي ق. لمستقبلات عديدة ، كثيرا ما يتم تحقيق معدل القياسات المباشرة التقامي باستخدام مستقبلات يغاندس المسمى. ومع ذلك ، لفئات كثيرة من البروتينات الغشاء ، مثل النقل ، ومضخات وقنوات أيون ، ليس هناك يجند مريحة والتي يمكن استخدامها لقياس معدل التقامي. في هذا التقرير ، ونحن تصف طريقة biotinylation عكسها التي نستخدمها لقياس نقل الدوبامين (DAT) معدل التقامي. هذا الأسلوب يوفر نهجا واضحة لقياس معدلات الاستيعاب ، ويمكن استخدامها بسهولة لدراسات الاتجار معظم البروتينات الغشاء.
Protocol
Discussion
المشاكل الشائعة : المشكلة الأكثر شيوعا التي تنشأ في هذه التجارب هو ضعف كفاءة القطاع. كفاءة قطاع حاسم في أن تكون قادرة على تفسير النتائج. إلا إذا كان الشريط كفاءة عالية ، فإنه ليس من الممكن أن نستنتج أن أي البروتينات biotinylated في الممرات استيعاب كانت ، في الواقع ، المن?…
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح # DA15169 من HEM
Referencias
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent. Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).
- Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization. Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).
- Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).
