衡量可逆的生物素的血浆膜蛋白吞价格

Summary

规管的内吞作用管辖的大部分膜蛋白在细胞表面的表达水平。在这里，我们利用还原，膜impermeant生物素化试剂的多巴胺转运蛋白（DAT），一个多面体的膜蛋白的内吞率来衡量的。该方法有利于一个简单的方法来测量大多数等离子的膜蛋白的内吞率。

Abstract

质膜蛋白是一种大型的，不同群体的蛋白质受体，离子通道，运输和泵组成。这些蛋白质的活性是负责各种关键的细胞活动，包括营养输送，细胞的兴奋性，和化学信号。许多质膜蛋白质吞贩运，调节通过改变蛋白的表面表达的蛋白质的功能是动态监管。促进蛋白质的内吞作用的机制，是复杂的，并不完全理解许多膜蛋白。为了充分了解的机制，控制某一特定蛋白质的内吞贩运，它是至关重要的蛋白S吞率精确测量。对于许多受体，直接吞率测量经常利用标记的受体的配体。然而，对于许多类，如运输，泵和离子通道的膜蛋白，有没有方便的配体，可以用来衡量吞率。在本报告中，我们描述了一个可逆的生物素的方法，我们聘请来衡量的多巴胺转运蛋白（DAT）的内吞率。这种方法提供了一个简单的方法来测量的内化率，并且可以很容易地雇用贩运大多数膜蛋白研究。

Protocol

程序概述： 使用这种方法，细胞表面的蛋白质共价键上标有使用贩运的限制性条件（即低温）下一个膜impermeant，二硫化碳耦合生物素试剂（磺酸基- NHS – SS -生物素）外赖氨酸残基与生物素（见图1插图）。一个细胞转移到贩卖宽松的条件下（37℃）和生物素化蛋白的内化。其他细胞保持在较低的温度控制为1）总时间= 0的表面蛋白，和2）剥离控制。一化后的短期内，细胞移回低?…

Discussion

常见问题 ：在这些实验中出现的最常见的问题是贫困地带效率。地带的效率是能够解释结果的关键。除非地带高效，是不可能得出结论，任何生物素化蛋白的内化车道，事实上，从表面上看内在​​。带≥90％的效率是最优的，和我们放弃任何结果，如果低于这个水平的地带。一个贫困地带的一个例子是如图3所示。请注意，在加沙地带车道的乐队是非常明显的，并对应一个34％的地带效率?…