תולעים טראנסגנטי משמשים בדרך כלל<em> ג elegans</em> מחקר. המתואר הוא פרוטוקול פשוט, אך יעיל, להציג transgenes לתוך תולעים באמצעות הפצצה biolistic עם DNA מצופה חלקיקי זהב. המאמץ הכרוך ואת התוצאות של הפצצה להשוות לטובה עם microinjection עבור הדור של חיות טרנסגניות.
Abstract
מספר מעבדות באמצעות C. חינם נמטודות חיים elegans הוא הולך וגדל במהירות. הפופולריות של הדגם הזה ביולוגי מיוחסת זמן הדור מהירה תוחלת חיים קצרה, תחזוקה קלה וזולה, רצף גנום מלא, מערך של RNAi משאבים בעלי חיים מוטציה. בנוסף, ניתוח של C. elegans הגנום גילה דמיון רב בין תולעים חוליות גבוהה, אשר טוען כי מחקר תולעים יכול להיות נספח חשוב מחקרים שבוצעו בעכברים כולו או תאים בתרבית. חלק חזק וחשוב של מחקר תולעת הוא היכולת להשתמש חיות טרנסגניות ללמוד לוקליזציה גן ותפקוד. בעלי חיים מהונדס ניתן ליצור גם באמצעות microinjection של germline התולעת או באמצעות הפצצה biolistic. הפצצה היא טכניקה חדשה והיא מוכרת פחות למספר מעבדות. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט לייצר תולעים מהונדס בהפצצות biolistic עם חלקיקי זהב באמצעות Bio-Rad PDS-1000 המערכת. בהשוואה microinjection דנ"א לתוך אנדרוגינוס germline, פרוטוקול זה יש את היתרון של לא דורש כישורים מיוחדים ממפעיל לגבי זיהוי האנטומיה תולעת או ביצוע microinjection. יתר על הקווים מהונדס מרובים מתקבלים בדרך כלל הפגזה אחת. כמו כן, בניגוד microinjection, הפגזה biolistic מייצרת חיות טרנסגניות עם שני מערכים extrachromosomal ו transgenes משולב. היכולת לקבל קווי מהונדס משולב יכול למנוע את השימוש של פרוטוקולים מוטגניות לשלב דנ"א זר. לסיכום, הפגזה biolistic יכולה להיות שיטה אטרקטיבי עבור הדור של חיות טרנסגניות, במיוחד עבור החוקרים לא מעוניין להשקיע את הזמן והמאמץ הדרושים כדי להיות מיומנים microinjection.
Protocol
סקירה תולעים מהונדס מסורתי נוצרו על ידי microinjecting DNA transgene לתוך C. elegans germline 1,2,3,4. אמנם מוצלח, גישה זו נדרש ציוד מיוחד ופיתוח ניסיון עם האנטומיה התולעת ואת הטכניקה microinjection. לאחרונה biolistic הפצצה פותחה כגישה חלופית אשר משתמשת DNA …
Discussion
הפגזה Biolistic היא שיטה פשוטה להציג דנ"א זר לתוך אורגניזמים רבים, כולל ג elegans1,5,6,7,16. הוא מסתמך על חלקיקי זהב ויצרו מורכבות עם ה-DNA בנוכחות CaCl 2. פוליאמינים קטיוני, כגון spermidine, להגן על ה-DNA מן השפלה nuclease in vivo. מאז spermidine הוא מולקולה יציב, חשוב לאחסן אותו aliquots ק…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרנות זרע מאוניברסיטת פיטסבורג NIH מענק AG028977 ל אלף
Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation. J. Vis. Exp. (42), e2090, doi:10.3791/2090 (2010).