Utilizzando il monte intero In situ Ibridazione a Link Biologia Molecolare e organismal

Summary

Intero monte<em> In situ</emIbridazione> (desiderio) è stato utilizzato in un corso di laurea alto livello comparata dei vertebrati Biologia oltre a vertebrati dissezioni. Questo ha dato agli studenti l'opportunità di studiare gli schemi di espressione genica e anatomia, che collega lo studio della biologia molecolare e organismal all'interno di un corso.

Abstract

Montare tutto ibridazione in situ (WISH) è una tecnica comune nei laboratori di biologia molecolare per studiare l'espressione genica attraverso la localizzazione di trascritti di mRNA specifico all'interno intero campione mount. Questa tecnica (adattato da Albertson e Yelick, 2005) è stato utilizzato in un superiore livello universitario comparativa aula laboratorio di Biologia dei Vertebrati alla Syracuse University. I primi due terzi del Comparative corso di laboratorio di Biologia dei Vertebrati ha dato agli studenti l'opportunità di studiare l'embriologia e anatomia degli organismi diversi che rappresentano diversi taxa cordati principalmente attraverso dissezioni tradizionale e l'uso di modelli. La parte finale del corso ha comportato un approccio innovativo per l'insegnamento dell'anatomia attraverso l'osservazione dello sviluppo dei vertebrati impiegando tecniche molecolari in cui è stata effettuata desiderio su embrioni di zebrafish. Un eterozigote fattore di crescita dei fibroblasti 8 bis (fgf8a) mutante linea, asso, è stato utilizzato. A causa di eredità mendeliana, asso incrociati prodotto wild-type, eterozigote e omozigote mutanti ace/fgf8a in un rapporto 01:02:01. Sonde di RNA con pattern di espressione nota sulla linea mediana e nello sviluppo di strutture anatomiche come il cuore, somiti, tailbud, myotome, e il cervello sono stati utilizzati. DESIDERO è stata effettuata utilizzando pesce zebra alla somite 13 e prim-6 tappe, con gli studenti di eseguire la reazione di colorazione in classe. Lo studio di embrioni di zebrafish a diversi stadi di sviluppo ha dato agli studenti la capacità di osservare come queste strutture anatomiche cambiata nel corso dell'ontogenesi. Inoltre, alcuni mutanti ace/fgf8a visualizzata looping improprio cuore e difetti di somite e lo sviluppo del cervello. Gli studenti in questo laboratorio di osservare il normale sviluppo dei vari apparati utilizzando sia l'anatomia esterni così come i modelli di espressione genica. Essi hanno inoltre identificato e descritto embrioni visualizzazione improprio sviluppo anatomico e di espressione genica (cioè, i mutanti putativo).

Per gli istruttori di istituzioni che non già in possesso delle attrezzature necessarie e dove i fondi per laboratorio e di innovazione curriculare sono limitate, il costo finanziario dei reagenti e gli apparecchi possono essere un fattore da considerare, così come il tempo e lo sforzo necessario da parte del istruttore indipendentemente dall'impostazione. Tuttavia, ci sostengono che l'uso del desiderio in questo tipo di impostazione in aula di laboratorio in grado di fornire un collegamento importante tra la genetica dello sviluppo e anatomia. L'avanzare della tecnologia e la capacità di studiare lo sviluppo organismal a livello molecolare diventa più facile, più economico, e sempre più popolare, molti biologi evoluzionisti, ecologisti, e fisiologi si stanno rivolgendo a strategie di ricerca nel campo della biologia molecolare. Utilizzando DESIDERANO in una comparativa aula laboratorio di Biologia dei Vertebrati è un esempio di come le molecole e anatomia possono convergere all'interno di un singolo corso. Questo dà agli studenti universitari di livello superiore la possibilità di praticare le moderne tecniche di ricerca biologica, portando a una formazione più diversificata e la promozione della futura ricerca scientifica interdisciplinare.

Protocol

1. Trasformazione plasmide di Target cDNA Parte I: Trasformazione di plasmidi (Tempo richiesto: 3 ore più notte di incubazione) SOC caldo brodo di coltura in un bagno d'acqua ° 42 C (500 microlitri per reazione) Scongelare le cellule competenti sul ghiaccio Aggiungere 1 ml plasmide a 25 microlitri cellule competenti Mettere in ghiaccio per 20 minuti Scossa cellule bagno di calore in 42 ° C acqua per 45 secondi Immediatamente posto le cellule in ghiaccio per 2 minuti Aggiungere 500 ml di 42 ° C brodo di coltura di ogni flaconcino di cellule Agitare a 37 ° C per 2 ore a 255 giri al minuto (rpm) Tavola 75 mix trasformazione microlitri su Luria Bertani (LB) piastre di agar Incubare le piastre invertita a 37 ° C per una notte Parte II: E. coli Cultura (Tempo richiesto: 15 minuti più incubazione overnight) Per ogni reazione, aliquota 3 ml di brodo LB e 3 ml di 50 mg / ml di ampicillina in un tubo di cultura Raschiare 1 colonia batteri dalla piastra di agar e aggiungere ad ogni provetta cultura Agitare provette di coltura a 37 ° C a 255 giri al minuto durante la notte Parte III: Prep plasmidi (Tempo richiesto: 1,5 ore) Isolare plasmide di culture durante la notte con il 5 Kit Primo Mini FastPlasmid (Catalogo # 2300000) Per verificare la presenza del plasmide preparato, eseguire il DNA eluito dal kit su un 1% di Tris-Acetato-EDTA (TAE) gel colorato con bromuro di etidio 2. In Situ DIG marcato Sintesi RNA sonda Parte I: Linearizzazione di plasmidi (Tempo richiesto: 2,5 ore) In una provetta da microcentrifuga 1,5 ml, si combinano: Preparato plasmidi 20 ml Enzima di restrizione * 2 ml Buffer ** 10 mL 10X sieroalbumina bovina (BSA) 10 mL Dietil pirocarbonato (DEPC) Acqua 58 ml 100 ml Incubare a 37 ° C per 2 ore * Varia con plasmide ** Varia con l'enzima di restrizione Parte II: Trascrizione (Tempo richiesto: 3 ore) In una provetta da microcentrifuga 1,5 ml, si combinano: Lineare plasmidi 4 mL Trascrizione Buffer 10X ** 4 mL Digossigenina Etichetta Mix 4 mL Polimerasi * 2 ml RNasi inibitore 2 ml DEPC acqua 24 ml 40 ml Incubare a 37 ° C per 1 ora Aggiungere 2 ml di * polimerasi Incubare a 37 ° C per 1 ora Aggiungere 2 ml di DNasi Incubare a 37 ° C per 20 minuti * Varia con plasmide ** Varia con la polimerasi Parte III: Precipitazioni (Tempo richiesto: 5 minuti più 2 ore per notte di incubazione, 1 ora di centrifugare e risospendere) Aggiungere 4 ml di EDTA 0,2 M Aggiungere 5 ml di cloruro di litio 4M Aggiungere 150 ml di etanolo freddo ghiaccio al 100% Incubare a -80 ° C per 2 ore a notte Centrifugare a 14.000 rpm per 30 minuti a 4 ° C, lontano decantare il surnatante Pellet secco per 7 minuti Risospendere in 20 microlitri di acqua DEPC Incubare a 37 ° C per 5 minuti Parte IV: Frazionamento – Eseguire solo se la dimensione della sonda è maggiore di 0,6 kb (Tempo richiesto: Varia in base alle dimensioni della sonda, di solito non più di 20 minuti) In una provetta da microcentrifuga 1,5 ml, si combinano: RNA sonda 20 ml DEPC acqua 12 ml Sodio Bicarbonato 4 mL Carbonato di sodio 4 mL 40 ml Incubare in un bagno d'acqua a 60 ° C. Base il tempo di incubazione sull'equazione: Tempo (min.) = (a partire kb – voluta kb) / (0,11 x a partire kb x desiderato kb) Media dimensione desiderata = 0,6 kb Parte V: Precipitazioni finale (Tempo richiesto: 5 minsce più 2 ore per notte di incubazione, 1 ora di centrifugare e ri-sospendere, 1 ora per elettroforesi su gel) Aggiungere 40 microlitri di acqua DEPC Aggiungere 8 microlitri di sodio acetato Aggiungi 1,04 microlitri di acido acetico glaciale Aggiungere 240 microlitri etanolo freddo ghiaccio al 100% Incubare a -80 ° C per 2 ore a notte Centrifugare a 14.000 rpm per 30 minuti a 4 ° C, lontano decantare il surnatante Pellet secco per 7 minuti Risospendere in 20 microlitri di acqua DEPC Vortex per miscelare Per verificare la presenza di riboprobe, eseguire il risospese in una soluzione 1% gel colorato TAE con bromuro di etidio 3. Montare tutto ibridazione in situ Parte I: Fissazione di embrioni e di digestione proteinasi K (Tempo richiesto: Fix più 4 ore durante la notte il giorno dopo per la conservazione, 2,5 ore da storage a parte II) Raccogliere in scena embrioni di zebrafish e fissare nel 4% paraformaldeide (PFA) notte a 4 ° C Lavare gli embrioni fissato in tampone fosfato contenente 0,1% di Tween-20 (PBST) 3 volte per 10 minuti ciascuno Per garantire l'esposizione degli embrioni ai reagenti sperimentale, gli embrioni dechorionate manualmente (se necessario) con pinze a punta fine Disidratare embrioni con il lavaggio in una serie graduata di 25% e 50% di metanolo in PBST per un'ora ogni lavaggio, quindi memorizzare in 100% di metanolo a -20 ° C Quando si è pronti ad utilizzare, reidratare gli embrioni in PBST con il lavaggio a 50% (2 volte) e il 25% (1 volta) metanolo in PBST per 10 minuti ciascuno. Infine lavare 2 volte per 10 minuti ciascuno in 100% PBST. Data esatta non è importante per PBST / metanolo lava Embrioni candeggina in una soluzione di perossido di idrogeno al 10% in PBST, se necessario, per rimuovere i pigmenti scuri. Gli embrioni devono incubare in una soluzione di perossido di idrogeno per 10-20 minuti, a seconda dell'età dell'embrione, e il tappo della provetta da microcentrifuga deve rimanere aperta per evitare l'accumulo di pressione dell'aria Embrioni digerire con 50 mg / ml proteinasi K diluito 1:5000 in PBST per 3-15 minuti, a seconda dell'età degli embrioni Ri-fix embrioni in PFA 4% per 30 minuti, e poi lavare 3 volte in PBST per 5 minuti ciascuno Parte II: ibridazione di Riboprobes (Tempo richiesto: 3 ore in più durante la notte per l'ibridazione, 1,5 ore il giorno successivo alla Parte III) Prehybridize embrioni con la soluzione prehybridization (PHS), in un caldo 70 ° C acqua bagno per 2-3 ore Rimuovere PHS, aggiungere 0,5 mL soluzione di ibridazione e di 1,5 microlitri precedentemente sintetizzato riboprobes digossigenina marcato, incubare a 70 ° C durante la notte. La temperatura può oscillare all'interno di pochi gradi a seconda del bersaglio riboprobe Il giorno dopo, lavare gli embrioni a 70 ° C in soluzioni graduali di 75%, 50% e 25% PHS di 2X citrato di soluzione fisiologica di sodio (SSC) per 10 minuti ciascuno, quindi lavare in SSC 0.2X per 30 minuti a 68 ° C Lavare in tampone di acido maleico (MAB) 2 volte per 10 minuti a temperatura ambiente Parte III: Anti-digossigenina (α-DIG) Incubazione Anticorpo (Tempo richiesto: 3 ore in più durante la notte per bloccare, 2,5 ore il giorno successivo alla Parte IV) Trasferimento degli embrioni a una piastra 12 pozzetti Pre-embrioni in blocco 1-2 mL di soluzione di blocco per almeno 3 ore a temperatura ambiente Allo stesso tempo, pre-blocco l'anticorpo preparando un secondo volume di soluzione di saturazione e diluendo il anticorpo anti-digossigenina 1:2000 in questa soluzione Rimuovere pre-blocco e aggiungere 1-2 ml di pre-bloccato α-DIG soluzione, incubare una notte a 4 ° C Il giorno dopo, lavare gli embrioni in MAB. Lasciare gli embrioni ad incubare in MAB per 5 minuti prima, quindi eseguire modifiche del buffer e incubare per due di 10 minuti, uno di 30 minuti e un intervallo di 60 minuti. Data esatta non è necessaria Lavare embrioni 3 volte per 5 minuti ciascuno in fosfatasi alcalina (AP) tampone Parte IV: La colorazione e trattamento finale (Tempo richiesto: 1 ora a notte per la colorazione, a seconda della riboprobe usato, 4 ore all'inizio della lava glicerolo, 6-10 ore per lavare glicerolo, possono essere conservati in glicerolo) Aggiungere 1-2 mL di soluzione colorante per gli embrioni, avvolgere la piastra in alluminio, colorazione e controllare a intervalli regolari (ogni 20 minuti circa) fino a colorazione è sufficiente Lavare gli embrioni con PBST 2 volte per 5 minuti ciascuno per fermare la reazione di colorazione Disidratare embrioni utilizzando 10 lavaggi minuti nel 25% (1 volta) e il 50% (2 volte) metanolo in PBST, poi in 100% di metanolo, per eliminare la colorazione di fondo Lasciare embrioni ad incubare in 100% di metanolo per almeno 2 ore a temperatura ambiente Reidratare in PBST con 10 lavaggi minuti nel 50% (2 volte) e il 25% (1 volta) metanolo in PBST, quindi lavare in 100% PBST 2 volte Trasferimento e coloratimbryos ad una soluzione di glicerolo 80% in PBST, utilizzando una serie graduata di lava, e conservare a 4 ° C. Ricette: Piastre di agar-10 LB agar LB g + 250 ml di acqua distillata, autoclave, quando fredde al tatto si aggiungano 250 microlitri ampicillina, versare 15-20 mL di soluzione calda in ogni scatola di Petri, permettono agar per solidificare LB brodo-12.5 g brodo LB + 200 ml di acqua distillata, autoclave, lasciare raffreddare prima dell'uso 1% TAE-gel 0.4 g di agarosio, 40 ml 1X TAE, 2 bromuro di etidio microlitri; carico 7 microlitri plasmide (plasmidi Trasformazione di Target cDNA) o 3 riboprobe microlitri di acqua e 4 microlitri DEPC (in situ DIG marcato Sintesi RNA Probe) + 1 tintura microlitri di carico, 5 scaletta del DNA microlitri Prehybridization soluzione-50% formammide, SSC 5X, 9.2mm acido citrico, 1% Tween-20 Ibridazione soluzione prehybridization soluzione più 500 mg / ml tRNA e 50 mg / mL di eparina MAB-100mm acido maleico, 150mm NaCl, NaOH 0,2 M, 0,1% Tween-20, il pH a 7,5 Blocco Soluzione-3 parti MAB, 1 parte di reagente al 10% Boehringer blocco in MAB, 1 parte di calore disattivato agnello siero AP buffer-60mm Tris-HCl pH 9.5, NaCl 60mm, 30mm MgCl 2, 0.1% Tween-20 Soluzione-5-Bromo-4-cloro-3-fosfato indolil colorazione (BCIP) e Nitro blu di tetrazolio (NBT) in tampone AP 4. RAPPRESENTANTE RISULTATI Quando eseguito correttamente, la reazione tra l'NBT, BCIP, e fosfatasi alcalina si formerà un precipitato viola che dovrebbe apparire sul pesce zebra embrione come una macchia viola. Riboprobes deve essere preventivamente sintetizzato da cDNA corrispondente al gene di interesse. Pertanto, si può concludere qualsiasi visualizzati macchia rappresenta le aree del pesce zebra in cui il gene di interesse è stato trascritto in quella fase particolare dello sviluppo. Ai fini di questo corso, sono stati sintetizzati da riboprobes aldh1a2 (precedentemente raldh2; Begemann et al, 2001;. Figura 1); fgf8a (Reifers et al, 1998;. Figura 2); deltaC (Oates et al, 2005.) myod1 (Weinberg et al, 1996.) shha (. Krauss et al, 1993), pax2a (Brand et al, 1996;. Figura 3) e myl7 (precedentemente cmlc2;. Yelon et al, 1999) cDNA. La colorazione era atteso sulla linea mediana e in strutture anatomiche tra cui il somiti, tailbud, myotome, cervello e cuore. Mutanti Ace/fgf8a ci si aspettava di avere difetti di molte di queste strutture. La colorazione era facilmente visualizzati utilizzando un microscopio standard di dissezione. Ulteriori fonti contengono maggiori informazioni e suggerimenti su Wish tecniche simili a quelle descritte qui (Clark, 2003;. Costa D'et al, 2009; Schmoldt et al, 2009;. Schoenwolf, 2009). Figura 1. Un embrione di zebrafish 24 ore dopo la fecondazione, che è stata ibridata con riboprobes specifici per aldh1a2. Colorazione specifica può essere vista negli occhi, romboencefalo, pinne pettorali gemma primordi, e somiti. Anteriore è al top, posteriore è al fondo. Figura 2. Un embrione di zebrafish allo stadio di 13 somiti di sviluppo che è stato ibridato con una sonda specifica per fgf8a. Colorazione specifica è visto nel telencefalo, diencefalo dorsale, mesencefalo-rombencefalo confine, somiti e tailbud. È ventrale a sinistra, dorsale è a destra. Figura 3. Un post 22 ore embrione fecondazione zebrafish che è stato ibridato con una specifica riboprobe per pax2a, un marker utile per la visualizzazione robusto il sistema nervoso. Colorazione specifica può essere visto nella fessura coroide, mesencefalo-rombencefalo confine, vescicola dell'orecchio, e neuroni del midollo spinale. Con vista dorsale anteriore a sinistra.

Discussion

Desiderio era utilizzato in un corso di laboratorio di Biologia comparata dei vertebrati per aiutare gli studenti a comprendere il ruolo della genetica nello sviluppo anatomico attraverso la visualizzazione di modelli noti di espressione genica. Per la prima parte del corso, gli studenti eseguito dissezioni sugli organismi che rappresentino più diversi taxa cordati, permettendo loro il tempo per studiare, capire, confrontare e vertebrati anatomia contrasto.

Come introduzione alla seconda parte del corso, gli studenti hanno ricevuto una lezione formale che descrive lo sviluppo zebrafish e anatomia. I metodi e risultati attesi dell'esperimento WISH sono stati anche discussi. Gli studenti hanno poi dato zebrafish vivo al somitogenesis e prim-6 fasi di sviluppo, ed a 2 e 5 giorni dopo la fecondazione (DPF) di esaminare al microscopio dissezione. Questo è stato quello di dare agli studenti una migliore comprensione di ciò che embrioni di zebrafish aspetto e le tipologie di cambiamenti morfologici che si verificano con l'ontogenesi.

Nella prossima sessione di laboratorio, gli studenti hanno ricevuto embrioni di zebrafish, in cui desiderio era stato precedentemente effettuato. Sono stati invitati a studiare e descrivere i pattern di espressione genica per ogni gene di interesse (riboprobe utilizzato). Gli embrioni utilizzati per DESIDERA sono stati ottenuti da accoppiamenti tra i membri di una linea eterozigoti ace/fgf8a. Sulla base di eredità mendeliana, il 25% degli embrioni da accoppiamenti ace/fgf8a dovevano essere omozigoti mutanti e di esporre i difetti di molte delle strutture anatomiche focalizzato su in questo corso. Sulla base delle relazioni pubblicate e osservazioni non pubblicate in laboratorio Albertson, difetti nel cervello e nel cuore loop improprio ci si aspettava, così come difetti del somiti (Brand et al, 1996;. Albertson e Yelick, 2005; osservazioni personali).

Agli studenti è stato chiesto di esaminare tutti i campioni, wild-type (animali eterozigoti sono indistinguibili da fratelli di tipo selvatico nelle fasi iniziali di sviluppo) e mutanti omozigoti, per ogni pattern di espressione genica presentato. Sono stati poi chiesto di scrivere relazioni di laboratorio che descrivono i loro risultati, e in base alla loro conoscenza dell'anatomia e della genetica, come espressione dei geni difettosi possono avere precipitato malformazioni anatomiche.

Studenti sembravano a ricevere questo esercizio di laboratorio con entusiasmo e curiosità. La maggior parte non avevano mai usato prima e DESIDERA erano estremamente interessati a questa parte del corso. Gli studenti trovano i diversi modelli di espressione genica in embrioni di zebrafish intrigante, alcuni addirittura descritto il pattern di colorazione visualizzati associandoli con i ben noti disegni e simboli, come ad esempio una faccina sorridente. Le relazioni di laboratorio risultante ha mostrato gli studenti avevano una comprensione generale del protocollo desiderio e l'espressione dei geni in specifiche strutture anatomiche. Gli studenti sono stati necessari per comprendere le funzioni specifiche dei geni studiati utilizzando WISH durante l'(Stickney et al, 2000 laboratorio;. Huelsken et al, 2002;. Geetha-Loganathan et al, 2008a;.. Gita-Loganathan et al, 2008b ). Era evidente però, che alcuni studenti hanno una conoscenza limitata di fondo delle vie di segnalazione e di geni di interesse. Ulteriori informazioni su questi concetti nel desiderio conferenza introduttiva potrebbe essere una gradita aggiunta per l'utilizzo del desiderio in futuro corsi di vertebrati Comparative Biology.

Dato che il protocollo richiede generalmente quattro giorni consecutivi, a seconda del calendario del corso, gli studenti possono solo essere in grado di completare una parte dell'esperimento in classe e l'istruttore deve essere responsabile per il resto. Nella nostra classe comparata Biologia dei Vertebrati, studenti hanno completato le reazioni colorazione in laboratorio, mentre l'Assistente didattico effettuato tutti i passaggi precedenti. Se si preferisce avere il WISH studenti svolgono in classe, il protocollo può essere diviso in subunità che può essere eseguito su diverse sessioni di laboratorio, a seconda del lasso di tempo della classe. Se non è possibile per gli studenti a svolgere l'intero protocollo, come è stato qui per l'incontro di laboratorio una volta alla settimana, gli studenti possono aggiungere la soluzione colorante all'inizio di classe e, a seconda del riboprobe usato, hanno la colorazione completa nel giro di un'ora. Il tempo necessario per la macchia di sviluppare varia notevolmente con ogni riboprobe e una varietà di condizioni sperimentali, e devono essere predeterminati prima classe. In particolare, se gli studenti saranno solo sviluppando la macchia in laboratorio, gli istruttori sarà responsabile per tutte le fasi precedenti, che richiederà tempo e risorse al di fuori della classe. Se lo si desidera, un'alternativa più breve di DESIDERA potrebbe essere immunoistochimica, utilizzando etichette di anticorpi per visualizzare la localizzazione delle proteine, tuttavia in questo momento, zebrafish anticorpi specifici per i geni dello sviluppo non sono facilmente disponibili. Un'altra opzione sarebbe quella di eseguire DESIDERA su diverse specie di vertebrati uno° gli studenti hanno confrontare i pattern di espressione degli stessi geni in diversi organismi (Pizard et al, 2004;. Aramaki et al, 2007;. Organismi modello emergente, 2008; organismi modello emergente, 2010).

L'obiettivo primario di utilizzare desiderio in un corso di biologia comparata dei vertebrati è stato quello di dimostrare agli studenti come vengono utilizzate tecniche di biologia molecolare per studiare lo sviluppo anatomico. Ha anche fornito l'opportunità per gli studenti di speculare su come modificare l'espressione genica può portare non solo a malformazioni di sviluppo, ma anche di cambiamento evolutivo. Formalizzato come la biologia evoluzionistica dello sviluppo (spesso definito come "evo-devo"), questo campo in rapida crescita di studio mira a collegare genotipo e fenotipo attraverso lo sviluppo, e di chiarire le basi meccanicistiche potenziale di cambiamento evolutivo. Con l'ascesa di questo campo, più ecologi, biologi organismal, e fisiologi stanno adottando tecniche molecolari nella loro ricerca. Ci sostengono che l'uso di desiderio in un corso di Biologia comparata dei Vertebrati contribuirà a mantenere il curriculum aggiornato con gli attuali progressi tecnologici e concettuali nella ricerca, e per facilitare un migliore allineamento orizzontale dei corsi di alto livello, combinando biologia sottocampi biologico. Inoltre, questo approccio integrato offrirà agli studenti l'opportunità di imparare una varietà di tecniche di ricerca biologica in un unico corso, portando a una formazione più diversificata e la promozione della futura ricerca scientifica interdisciplinare.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
5 Prime Fast Plasmid Mini Kit (100 preps)		Fisher	2300000
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli with SOC Medium		Invitrogen	C404003
LB Agar		Fisher	BP1425-500
LB Broth		Fisher	BP1426-500
Ampicillin Sodium Salt		Fisher	BP1760-5
Isopropanol		Acros	42383-0010
Petri Dish 100 x 20 mm non treated		Laboratory Products Sales	430591
14 ml Culture Tube, Snap Top		Fisher	1495911B
Restriction Enzymes & Buffers & 10xBSA		New England Bio Labs	varies
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) 25 ml		Sigma	D5758-25mL
Sodium Acetate Trihydrate USP/FCC 500g		Fisher	s608500
Gal 200 proof Ethyl alcohol		Fisher	04-355-451
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x Sol 1L		Fisher	bp13321
Agarose Low EEO 100 g		Fisher	BP160-100
Ethidium Bromide 10 ml		Sigma	45-E1510
Sucrose Gel Loading Dye 40% Sucrose		Fisher	BP655-1
1 kb Full Scale DNA Ladder		Fisher	BP2582200
DIG RNA Labeling Mix		Roche	11277073910
T3 RNA Polymerase		Roche	1031163
T7 RNA Polymerase		Roche	10881767001
SP6 RNA Polymerase		Roche	810274
Protector Rnase Inhibitor		Roche	3335399001
Dnase I, Rnase Free 10,000 units		Roche	4716728001
EDTA molecular biology reagent		Sigma	e5134-500G
Lithium Chloride 100 g		Fisher	L121100
Sodium Carbonate 1 kg		Fisher	BP357-1
Sodium Bicarbonate, 500 g		Fisher	BP328-500
Acetic Acid glacial ACS 500 ml		Fisher	a38500
Paraformaldehyde R 500 g		Fisher	o4042500
PBS Phosphate Buffer Saline 10X		Fisher	bp3991
Tween 20 500 ml		Fisher	bp337500
Methanol 5 L		Fisher	A4124
Proteinase K 50 mg		Fisher	bp170050
Formamide 1 L		Fisher	F841
20x SSC 1 L		Fisher	bp13251
Citric Acid Anhydrous ACS 500 g		Fisher	a940500
Ribonucleic acid transfer type V		Sigma	r7876-2.5KU
Heparin Sodium salt 50 mg		Fisher	bp252450
Maleic acid R 500 g		Fisher	o3417500
Sodium Chloride 500 g		Fisher	s271500
Sodium Hydroxide 500 g		Fisher	s318500
Blocking Reagent		Roche	11096176001
Lamb Serum 500 ml		Invitrogen	16070096
Anti DIG AP fragments		Roche	11093274910
2M Tris Solution 500 ml		Fisher	bp1759500
Magnesium Chloride 500 g		Fisher	m33500
BCIP 3 ml		Roche	11383221001
NBT 3 ml		Roche	11383213001
Glycerol 99% 2.5 L		Fisher	AC158920025
Plate 12 well PS ST w/Lid		VWR	62406-165
Tube 15 ml screw cap 50/rack 500/cs		Laboratory Products Sales	L262861
Tube 50 ml screw cap 25/rack 500/cs		Laboratory Products Sales	L262890
1.6 ml microfuge tube		Laboratory Products Sales	L234401
2 Parafilm 2″ x 250 ft		Fisher	s37441
Transfer Pipet 7 ml		USA Scientific	1020-2520
.1-10 μl Pipet Tip, Bulk		USA Scientific	1111-3000
1-200 μl Pipet Tip, Bulk		USA Scientific	1111-0006
101-1000 μl Pipet Tip, Bulk		USA Scientific	1111-2021
Aluminum Foil		Grocery Store

• Autoclave
• Micro-centrifuge
• 37°C incubator (with shaker)
• 4°C micro-centrifuge
• Water bath
• Vortex
• Gel electrophoresis apparatus
• -20°C freezer
• -80°C freezer
• Rocker/shaker
• 4°C refrigerator
• Dissecting microscope (preferably with a teaching screen or camera)