Nachweis von Stickstoffmonoxid und Superoxid-Radikalanion von paramagnetischer Resonanzspektroskopie von Zellen mit Spinfallen
Summary
Elektronenspin-Resonanz (EPR)-Spektroskopie wurde eingesetzt, um Stickoxid aus Rinder-Endothelzellen und Superoxidradikalanion von menschlichen Neutrophilen unter Verwendung von Eisen (II)-N-Methyl-D-glucamin Dithiocarbamat, Fe (MGD) erkennen<sub> 2</sub> Und 5,5-Dimethyl-1-pyroroline-N-oxid, DMPO, jeweils.
Abstract
Reaktivem Stickstoff / Sauerstoff-Spezies (ROS / RNS) in geringen Konzentrationen spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Zellfunktion, Signal-, und Immunantwort aber in unregulierten Konzentrationen sind schädlich für die Lebensfähigkeit der Zellen 1, 2. Während lebenden Systemen mit endogenen und diätetische antioxidativen Mechanismen entwickelt, um ROS zu regulieren, werden ROS kontinuierlich natürliche Nebenprodukte der normalen Stoffwechsel von Sauerstoff erzeugt und kann oxidativen Schäden an Biomolekülen was zu einem Verlust der Funktion des Proteins, DNA-Spaltung, oder Lipid zu Peroxidation 3, und schließlich gegen oxidativen Stress, der zu Verletzung oder Tod Zelle 4.
Superoxid-Radikal-Anion (O 2 • -) ist das wichtigste Vorläufer einige der stark oxidierenden Spezies, auf die in biologischen Systemen, wie Peroxynitrit und Hydroxylradikale abgegeben. Die Erzeugung von O 2 • – signalisiert den ersten Anzeichen von oxidativem Burst, und deshalb habe ichts Nachweis und / oder Speicherung in biologischen Systemen wichtig ist. In dieser Demonstration O 2 • – wurde von neutrophilen Granulozyten (PMN) generiert. Durch chemotaktische Stimulation mit Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA), erzeugt PMN O 2 • – über die Aktivierung von Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (NADPH) Oxidase 5.
Stickoxid (NO)-Synthase, die in drei Isoformen kommt, induzierbare-, neuronale und Endothel-NOS oder iNOS, nNOS oder eNOS, jeweils, katalysiert die Umwandlung von L-Arginin, L-Citrullin, mit NADPH, um NO 6 zu erzeugen . Hier erzielten wir NO aus Endothelzellen. Unter oxidativem Stress kann zum Beispiel von eNOS Herstellung NO zu O 2 • wechseln – in einem Prozess namens Entkopplung, die vermutlich durch Oxidation von Häm-7 oder der Co-Faktor, Tetrahydrobiopterin (BH 4) 8 verursacht wird.
Es gibt nur wenigezuverlässiger Verfahren zur Detektion von freien Radikalen in biologischen Systemen, aber von Spezifität und Sensitivität begrenzt. Spin trapping wird allgemein für die Identifizierung von freien Radikalen verwendet und umfasst die Addition von einem Rest einer Spin-Trap Bilden einer persistenten Spinadduktes, die durch paramagnetische Elektronenresonanz (EPR)-Spektroskopie nachgewiesen werden kann. Die verschiedenen Radikaladdukte zeigen markante Spektrum, mit dem die Radikale erzeugt identifizieren und können eine Fülle von Informationen über die Art und Kinetik der Radikal-Produktion 9 bieten kann.
Die cyclischen Nitrone, 5,5-Dimethyl-pyrrolin-N-oxid, DMPO 10, die Phosphoryl-substituiert DEPMPO 11 und die Ester-substituierte, EMPO 12 und BMPO 13, werden weithin als Spinfallen verwendet – letztere Spin Fallen ausstellenden längere Halbwertszeiten für O 2 • – Addukt. Eisen (II)-N-Methyl-D-glucamin Dithiocarbamat, Fe (MGD) 2 </ Sub> wird häufig verwendet, um die NO aufgrund der hohen Rate von Adduktbildung und der hohen Stabilität des Spin-Addukt 14 abfangen.
Protocol
Discussion
EPR Spin trapping wurde in einem weiten Bereich von biomedizinische Anwendungen für die Quantifizierung und Identifizierung von freien Radikalen verwendet. Spin trapping ist hochempfindlich, zum Aufspüren von Resten in Konzentrationen von nM bis uM eignet sich daher für die Anwendung in biologischen Systemen. Die Bildung des paramagnetischen Addukt, NO-Fe 2 +-MGD, ist die Basis der NO-Erkennung durch EPR. Fe 2 +-MGD reagiert mit NO schnell 18 an einer Rate von ~ 10 6</su…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den NIH National Heart, Lung, and Blood Institute Zuschuss RO1 HL81248 finanziert.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phenol free DMEM medium High glucose 1X |
GIBCO | 31053 | |
| 0.25% Trypsin- EDTA | GIBCO | 25200 | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| MEM Non Essential Amino acids | GIBCO | 11140 | |
| Fetal Bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Endothelial Growth factor | Millipore | 02-102 | |
| CaI | Enzo Life Sciences | A-23187 | Dissolve in DMSO |
| SIN-1 | Enzo Life Sciences | BML-CN245-0020 | |
| DMPO | Dojindo Laboratories | D048-10 | |
| FeSO4.7H2O | Sigma Aldrich | 215422-250G | Dissolve in PBS with Ca and Mg |
| MGD | Enzo Life Sciences | ALX-400-014-M050 | Dissolve in PBS with Ca2+ and Mg2+ |
| BAEC cells | Cell Systems | 2B2-C75 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DPBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| Phorbol-myristate acetate (PMA) | Sigma Aldrich | 79346-1MG |
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