Bromodeossiuridina (BrdU) Etichettatura e successive ordinamento fluorescenza cellulare attivo per la cultura indipendente Identificazione di carbonio organico disciolto-degradanti batterioplancton
Summary
Batterioplancton ambientali vengono incubate con un modello di carbonio organico disciolto (DOC) e un reattivo composto di etichettatura del DNA, bromodeossiuridina (BrdU). In seguito, DOC-degradante celle sono separate dalla comunità di massa in base alla loro elevata incorporazione di BrdU usando fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS). Queste cellule vengono poi identificati da successive analisi molecolari.
Abstract
I microbi sono agenti principali mediare la degradazione di numerosi carbonio organico disciolto (DOC) substrati in ambienti acquatici. Tuttavia, l'identificazione di taxa batterici che trasformano piscine specifiche di DOC in natura rappresenta una sfida tecnica.
Qui si descrive un approccio che le coppie bromodeossiuridina (BrdU) l'incorporazione, fluorescenza cell sorting attivato (FACS) e 16S rRNA gene-based analisi molecolare che consente di cultura indipendente identificazione di batterioplancton in grado di degradare un composto DOC specifico in ambienti acquatici. Microcosmi batterioplancton tre esemplari sono impostati per ricevere sia BrdU e un composto modello DOC (DOC emendamenti), oppure solo BrdU (senza aggiunta di controllo). Sostituti BrdU le posizioni di timidina nel DNA di nuova sintesi batterica e BrdU marcato DNA può essere facilmente immunodetected 1,2. Attraverso una 24-ore di incubazione, batterioplancton che sono in grado di utilizzare il composto aggiunto DOC dovrebbero essere selettivamente attivato, e quindi hanno più alti livelli di incorporazione di BrdU (cellule HI) che non rispondono le cellule negli emendamenti DOC e le cellule nel no- Inoltre controlla (basso cellule incorporazione di BrdU, le cellule LI). Dopo immunolocalizzazione fluorescenza, le cellule si distinguono HI e fisicamente separato dalle cellule LI da fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS) 3. Ordinati DOC-responsive cellule (cellule HI) vengono estratte per il DNA e tassonomicamente individuate attraverso successive rRNA 16S a base genetica tra cui analisi di PCR, la costruzione della libreria clone e sequenziamento.
Protocol
Discussion
Il nostro approccio coppie BrdU incorporazione, FACS analisi e 16S rDNA per consentire l'identificazione delle specie a livello di batterioplancton che metabolizzano i singoli componenti DOC in ambienti acquatici. Il saggio di incorporazione di BrdU etichette cellule batteriche sulla base di attività metabolica, che permette l'analisi solo sui batteri attivi e quindi non include le cellule dormienti. Nel nostro approccio, incorporazione di BrdU è nei batteri in situ immunodetected e che hanno…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il finanziamento di questo progetto è stato fornito dal National Science Foundation concede OCE1029607 (a XM) e MCB0702125 (a MAM) e Gordon and Betty Moore Foundation (a MAM).
Materials
| Name | Tipo | Company | Catalog number | Comments |
| BrdU | Reagent | Sigma | B5002-5G | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma | L6876-5G | |
| Proteinase K | Reagent | Sigma | P2308-25MG | |
| In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS | Kit | Roche | 11810740001 | Consume more of Anti-BrdU-FLUOS and Incubation buffer per reaction than suggested by the manufacturer. |
| Frame-Seal Incubation Chambers | Material | Bio-Rad | SLF-1201 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (142-mm-diameter, 1.0 μm-pore-size) | Material | Millipore | FALP14250 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (25-mm-diameter, 0.2 μm-pore-size) | Material | Millipore | FGLP02500 | |
| illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads | Kit | GE Healthcare | 27-9559-01 | |
| QIAquick gel extraction kit | Kit | QIAGEN | 28704 | |
| FailSafe PCR System | Kit | EPICENTRE | FS99060 |
Referencias
- Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).
- Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J. Immunochemical detection and isolation of DNA from metabolically active bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 65, 1207-12 (1999).
- Mou, X. Z., Hodson, R. E., Moran, M. A. Bacterioplankton assemblages transforming dissolved organic compounds in coastal seawater. Environ. Microbiol. 9, 2025-2025 (2007).
- Hodson, R. E., Dustman, W. A., Garg, R. P., Moran, M. A. In situ PCR for visualization of microscale distribution of specific genes and gene products in prokaryotic communities. Appl. Environ. Microbiol. 61, 4074-4074 (1995).
- Dinjens, W. N. Bromodeoxyuridine (BrdU) immunocytochemistry by exonuclease III (Exo III) digestion. Histochemistry. 98, 199-199 (1992).
- Kirchman, D. L., Yu, L. Y., Fuchs, B. M., Amann, R. Structure of bacterial communities in aquatic systems as revealed by filter PCR. Aquat. Microb. Ecol. 26, 13-13 (2001).
- Delong, E. F., Wickham, G. S., Pace, N. R. Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells. Science. 243, 1360-1360 (1989).
- Artursson, V., Jansson, J. K. Use of bromodeoxyuridine immunocapture to identify active bacteria associated with arbuscular mycorrhizal hyphae. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6208-6208 (2003).
- Mou, X. Z. Bacterial carbon processing by generalist species in the coastal ocean. Nature. 451, 708-708 (2008).
- Mou, X. Flow-cytometric cell sorting and subsequent molecular analyses for culture-independent identification of bacterioplankton involved in dimethylsulfoniopropionate transformations. Appl. Environ. Microbiol. 71, 1405-1405 (2005).
- Dean, F. B. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5261-5261 (2002).
