Бромдезоксиуридин (BrdU) Маркировка и последующих флуоресценции Активированный сотовый Сортировка по культуре независимой Определение растворенного органического углерода, разрушающих бактериопланктона
Summary
Экологические бактериопланктона инкубируют с моделью растворенного органического углерода (DOC) соединения и реагента ДНК маркировки, бромдезоксиуридин (BrdU). Потом, DOC-унижающие клетки отделяются от основной массы сообщества, основанного на поднятом включения BrdU с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS). Эти клетки затем определили последующими молекулярного анализа.
Abstract
Микробы являются основными агентами посредническую деградации многочисленных растворенного органического углерода (DOC) субстратов в водной среде. Тем не менее, выявление бактериальных таксонов, которые преобразуют конкретных пулов DOC в природе представляет собой сложную техническую задачу.
Здесь мы опишем подход, что пары бромдезоксиуридин (BrdU) регистрации, флуоресценции активирован сортировки клеток (FACS) и 16S рРНК генов основе молекулярного анализа, который позволяет культуры независимой идентификационной бактериопланктона, способных разлагать конкретного соединения DOC в водной среде. Микрокосмы Triplicate бактериопланктона настроены получить как BrdU и соединения модели DOC (DOC изменениями и дополнениями), или только BrdU (без того контроля). BrdU заменителей позиции тимидина во вновь синтезированной ДНК бактерий и BrdU-меченых ДНК могут быть легко immunodetected 1,2. Через 24-часовая инкубация, бактериопланктона, которые способны использовать добавил соединения DOC как ожидается, будут выборочно активирован, и, следовательно, имеют более высокие уровни включения BrdU (HI клеток), чем не отвечающих клеток в поправках DOC и клеток в не- Помимо контроля (низкое включение BrdU клетки, Л. И. клетки). После флуоресценции иммунодетекции, HI клетки отличаются и физически отделены от клетки Л. И. флуоресцентной активированный сортировки ячейки (FACS) 3. Сортировать DOC проблематику клеток (HI клеток) извлекаются для ДНК и таксономически, выявленных в ходе последующего гена 16S рРНК основе анализа, включая ПЦР, клонирование строительство библиотеки и последовательности.
Protocol
Discussion
Наш подход пары BrdU регистрации, FACS и 16S рДНК анализ, чтобы на уровне видов идентификации бактериопланктона, которые усваивают отдельные компоненты DOC в водной среде. Анализ BrdU включения этикетки бактериальных клеток на основе метаболической активности, которая позволяет анализировать…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование данного проекта была осуществлена Национальным научным фондом OCE1029607 гранты (до XM) и MCB0702125 (для МАМ) и Гордона и Бетти Мур Фонд (по МАМ).
Materials
| Name | Tipo | Company | Catalog number | Comments |
| BrdU | Reagent | Sigma | B5002-5G | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma | L6876-5G | |
| Proteinase K | Reagent | Sigma | P2308-25MG | |
| In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS | Kit | Roche | 11810740001 | Consume more of Anti-BrdU-FLUOS and Incubation buffer per reaction than suggested by the manufacturer. |
| Frame-Seal Incubation Chambers | Material | Bio-Rad | SLF-1201 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (142-mm-diameter, 1.0 μm-pore-size) | Material | Millipore | FALP14250 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (25-mm-diameter, 0.2 μm-pore-size) | Material | Millipore | FGLP02500 | |
| illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads | Kit | GE Healthcare | 27-9559-01 | |
| QIAquick gel extraction kit | Kit | QIAGEN | 28704 | |
| FailSafe PCR System | Kit | EPICENTRE | FS99060 |
Referencias
- Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).
- Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J. Immunochemical detection and isolation of DNA from metabolically active bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 65, 1207-12 (1999).
- Mou, X. Z., Hodson, R. E., Moran, M. A. Bacterioplankton assemblages transforming dissolved organic compounds in coastal seawater. Environ. Microbiol. 9, 2025-2025 (2007).
- Hodson, R. E., Dustman, W. A., Garg, R. P., Moran, M. A. In situ PCR for visualization of microscale distribution of specific genes and gene products in prokaryotic communities. Appl. Environ. Microbiol. 61, 4074-4074 (1995).
- Dinjens, W. N. Bromodeoxyuridine (BrdU) immunocytochemistry by exonuclease III (Exo III) digestion. Histochemistry. 98, 199-199 (1992).
- Kirchman, D. L., Yu, L. Y., Fuchs, B. M., Amann, R. Structure of bacterial communities in aquatic systems as revealed by filter PCR. Aquat. Microb. Ecol. 26, 13-13 (2001).
- Delong, E. F., Wickham, G. S., Pace, N. R. Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells. Science. 243, 1360-1360 (1989).
- Artursson, V., Jansson, J. K. Use of bromodeoxyuridine immunocapture to identify active bacteria associated with arbuscular mycorrhizal hyphae. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6208-6208 (2003).
- Mou, X. Z. Bacterial carbon processing by generalist species in the coastal ocean. Nature. 451, 708-708 (2008).
- Mou, X. Flow-cytometric cell sorting and subsequent molecular analyses for culture-independent identification of bacterioplankton involved in dimethylsulfoniopropionate transformations. Appl. Environ. Microbiol. 71, 1405-1405 (2005).
- Dean, F. B. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5261-5261 (2002).
