Bilaminar Co-cultuur van primaire Rat corticale neuronen en Glia
Summary
Hier hebben we een protocol voor het kweken van rat corticale neuronen in de aanwezigheid van een gliale feeder-laag. De gekweekte neuronen tot stand polariteit en creëren synapsen, en kan gescheiden worden van de glia voor gebruik in diverse toepassingen, zoals electrofysiologie, calcium imaging, overleving van de cel assays, immunocytochemie, en RNA / DNA / eiwit isolatie.
Abstract
Deze video zal u begeleiden door het proces van het kweken rat corticale neuronen in de aanwezigheid van een gliale feeder-laag, een systeem dat bekend staat als een bilaminar of co-cultuur model. Dit systeem is geschikt voor een verscheidenheid aan experimentele behoeften die ofwel een glazen of plastic ondergrond groei en kan ook gebruikt worden voor de cultuur van andere soorten neuronen.
Rat corticale neuronen verkregen uit de late embryonale stadium (E17) zijn uitgeplaat op dekglaasjes of weefselkweek gerechten te maken met een feeder laag van glia geteeld op schotels of plastic dekglaasjes (bekend als Thermanox), respectievelijk. De keuze tussen de twee configuraties afhankelijk van de specifieke gebruikte experimentele techniek, die aanleiding kunnen geven, of niet, dat de neuronen gekweekt op glas (bv. calcium beeldvorming ten opzichte van Western blot). De gliale feeder-laag, een astroglia verrijkte secundaire cultuur van gemengde glia, wordt afzonderlijk bereid uit de cortex van pasgeboren ratten pups (P2-4) voorafgaand aan de neuronaledissectie.
Een groot voordeel van deze cultuur systeem in vergelijking met een cultuur van neuronen is alleen de steun van neuronale groei, de overleving en differentiatie door trofische factoren afgescheiden van de gliale feeder-laag, aangezien dit beter in de hersenen omgeving lijkt in vivo. Bovendien kan de co-cultuur worden gebruikt om de neuronale-gliale interacties een studie.
Op hetzelfde moment, is glia verontreiniging in de neuronale laag voorkomen worden door verschillende middelen (low density cultuur, toevoeging van mitotische remmers, gebrek aan serum en het gebruik van geoptimaliseerde cultuur medium) die leidt tot een vrijwel pure neuronale laag, vergelijkbaar met andere gevestigde methoden een -3. Neuronen kunnen eenvoudig worden gescheiden van de gliale laag op elk moment tijdens de cultuur-en gebruikt worden voor verschillende experimentele toepassingen, variërend van de elektrofysiologie 4, cellulaire en moleculaire biologie 5-8, biochemie 5, imaging en microfoonroscopy 4,6,7,9,10. De primaire neuronen uit te breiden axonen en dendrieten te vormen functionele synapsen 11, een proces dat niet is waargenomen in neuronale cellijnen, hoewel sommige cellijnen niet uitstrekken processen.
Een gedetailleerd protocol van het kweken van rat hippocampale neuronen het gebruik van deze co-cultuur systeem is eerder 4,12,13 beschreven. Hier hebben we een detail aangepast protocol geschikt is voor corticale neuronen. Aangezien ongeveer 20×10 6 cellen worden gewonnen uit elke rat embryo, deze methode is vooral handig voor experimenten waarbij grote aantallen neuronen (maar niet bezorgd over een zeer homogene neuronale populatie). De voorbereiding van neuronen en gliacellen moet worden gepland in een tijd-specifieke wijze. Wij zullen de stap-voor-stap protocol voor het kweken van rat corticale neuronen en gliacellen kweken om de neuronen ondersteunen.
Protocol
Discussion
Dit protocol biedt een methode voor het kweken van rat primaire corticale neuronen in de aanwezigheid van glia cellen, terwijl de neuronen gemakkelijk kunnen worden geïsoleerd voor experimentele analyse. De glia helpen bij de ontwikkeling van een gezonde neuronaal fenotype, terwijl ook modulerende neuronale reacties op experimentele behandelingen in een fysiologisch relevante manier. Bovendien, door passage van de primaire glia voor het kweken met deze neuronen celpopulatie wordt selectief verrijkt met astrocyten, waar…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken vorige laboratorium leden die hebben bijgedragen aan de verfijning van dit protocol en de NIH voor ondersteuning door de jaren heen (DA19808 en DA15014 naar OM). Anna Abt 1 is een fellow van de "Interdisciplinaire en Translationeel Onderzoek Opleiding in neuroAIDS" (T32-MH078795), en bijgevolg dit werk werd mede ondersteund door de National Institutes of Health onder Ruth L. Kirschstein National Research Service Award 5T32MH079785.
Materials
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Glucose | 16 mM |
| Sucrose | 22 mM |
| NaCl | 135 mM |
| KCl | 5 mM |
| Na2HPO4 | 1 mM |
| KH2PO4 | 0.22 mM |
| HEPES | 10 mM |
| pH | 7.4 |
| Osmolarity | 310±10 mOsm |
Table 1. Dissection Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| FBS | 10% |
| Gentamicin | 50 μg/mL |
Tabe 2. Glia Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| Horse Serum | 10% |
Table 3. Neuron Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 98% |
| N2 Supplement | 1% |
| 1M HEPES | 1% |
| Ovalbumin | 50 mg/100mL |
Table 4. N2 Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Boric Acid | 50 mM |
| Sodium Borate | 12.5 mM |
Table 5. Borate Buffer (for poly-lysine).
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) |
Invitrogen | 11995-073 |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat-inactivated | Hyclone | 26400-044 |
| Horse Serum, Heat-inactivated | Hyclone | H1138 |
| Gentamicin (50mg/mL) | Invitrogen | 15750-060 |
| N2 Supplement (100x) | Invitrogen | 17502-048 |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 |
| Albumin from chicken egg white, Grade VI (Ovalbumin) |
Sigma-Aldrich | A2512 |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen | 15090-046 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) |
Sigma-Aldrich | D-5025 |
| Paraplast | Fisher | 12-646-106 |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1274 |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma-Aldrich | C6645 |
| Stereomicroscope | Leica | Leica ZOOM 2000 |
| Cover glasses, Circles, 15 mm, Thickness 0.13-0.17 mm |
Carolina | 633031 |
| Thermanox sheets | Grace BioLabs | HS4550 |
| Large forceps | Biomedical Investigación Instruments |
70-4000 |
| Fine-tipped No.5 forceps | Fine Science Tools |
91150-20 |
| Pattern No.1 forceps | Biomedical Investigación |
10-1400 |
| Instruments | ||
| Scissors, straight, sharp-blunt | Biomedical Investigación Instruments |
28-1435 |
| Micro Dissecting scissors | Biomedical Investigación Instruments |
11-2070 |
| Micro Dissecting Curved scissors | Biomedical Investigación Instruments |
11-1395 |
Referencias
- Cook, A. Interactions between chemokines: regulation of fractalkine/CX3CL1 homeostasis by SDF/CXCL12 in cortical neurons. J. Biol. Chem. 285, 10563-10563 (2010).
- Nicolai, J., Burbassi, S., Rubin, J., Meucci, O. CXCL12 inhibits expression of the NMDA receptor’s NR2B subunit through a histone deacetylase-dependent pathway contributing to neuronal survival. Cell. Death. Dis. 1, e33-e33 (2010).
- Sengupta, R. Morphine increases brain levels of ferritin heavy chain leading to inhibition of CXCR4-mediated survival signaling in neurons. J. Neurosci. 29, 2534-2544 (2009).
- Meucci, O. Chemokines regulate hippocampal neuronal signaling and gp120 neurotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 14500-14500 (1998).
- Khan, M. Z. Regulation of neuronal P53 activity by CXCR 4. Mol. Cell. Neurosci. 30, 58-66 (2005).
- Patel, J. P. Modulation of neuronal CXCR4 by the micro-opioid agonist DAMGO. J. Neurovirol. 12, 492-500 (2006).
- Shimizu, S. Role of the transcription factor E2F1 in CXCR4-mediated neurotoxicity and HIV neuropathology. Neurobiol. Dis. 25, 17-26 (2007).
- Khan, M. Z. The chemokine receptor CXCR4 regulates cell-cycle proteins in neurons. J. Neurovirol. 9, 300-314 (2003).
- Khan, M. Z. The chemokine CXCL12 promotes survival of postmitotic neurons by regulating Rb protein. Cell. Death. Differ. 15, 1663-1672 (2008).
- Khan, M. Z., Vaidya, A., Meucci, O. CXCL12-mediated regulation of ANP32A/Lanp, a component of the inhibitor of histone acetyl transferase (INHAT) complex, in cortical neurons. J. Neuroimmune. Pharmacol. 6, 163-170 (2011).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8, 1454-1468 (1988).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Goslin, K., Banker, G., Goslin, K., Banker, G. . Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
- D’Ambrosio, J., Fatatis, A. Osteoblasts modulate Ca2+ signaling in bone-metastatic prostate and breast cancer cells. Clin. Exp. Metastasis. 26, 955-964 (2009).
