כאן אנו מספקים פרוטוקול עכברוש נוירונים בקליפת המוח culturing בנוכחות שכבה מזין גליה. נוירונים בתרבית להקים הקוטביות וליצור סינפסות, והוא יכול להיות מופרד גליה לשימוש ביישומים שונים, כגון electrophysiology, הדמיה סידן, מבחני הישרדות התא, immunocytochemistry, ו-RNA / DNA / בידוד החלבון.
סרט הווידאו הזה ינחה אותך בתהליך של עכברוש נוירונים בקליפת המוח culturing בנוכחות שכבה מזין גליה, מערכת המכונה bilaminar או שיתוף תרבות מודל. מערכת זו מתאימה למגוון צרכים הדורשים ניסיוני או כוס או מצע גידול פלסטיק יכול לשמש גם עבור התרבות של סוגים אחרים של נוירונים.
נוירונים בקליפת המוח עכברוש המתקבל בשלב עוברי מאוחר (E17) הם על coverslips מצופה זכוכית או בתרבית רקמה מנות מול שכבת מזין של גליה גדל על כלים או coverslips פלסטיק (המכונה Thermanox), בהתאמה. הבחירה בין שתי תצורות תלוי בטכניקה ניסויית מסוימת בשימוש, אשר עשויים לדרוש, או לא, נוירונים, כי הם גדלו על זכוכית (למשל, הדמיה סידן לעומת המערב כתם). השכבה מזין גליה, תרבות astroglia מועשר המשני של גליה מעורבת, מוכן בנפרד הקורטקס של גורי חולדה היילוד (P2-4) לפני העצביתדיסקציה.
היתרון העיקרי של מערכת זו תרבות לעומת תרבות של נוירונים היחיד הוא תמיכה של צמיחה הישרדות העצבית, והבחנה המסופקים על ידי גורמים trophic המופרשים מהשכבה מזין גליה, אשר דומה בצורה מדויקת יותר את הסביבה המוח in vivo. יתר על כן, שיתוף התרבות יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות עצביות, גליה 1.
במקביל, זיהום גליה בשכבת העצבית נמנעת באמצעים שונים (תרבות צפיפות נמוכה, תוספת של מעכבי mitotic, חוסר להשתמש בסרום של המדיום תרבות אופטימיזציה) המובילה בשכבה עצבי טהור כמעט, בהשוואה לשיטות אחרות שהוקמו 1 -3. נוירונים ניתן להפריד בקלות בכל עת מהשכבה גליה במהלך התרבות משמשת ליישומים ניסויים שונים הנעים בין 4 electrophysiology, ביולוגיה תאית ומולקולרית 5-8, 5 ביוכימיה, הדמיה מיקרופוןroscopy 4,6,7,9,10. הנוירונים העיקרי להאריך אקסונים דנדריטים וסינפסות כדי ליצור תפקודית 11, תהליך אשר אינו שנצפתה שורות תאים עצביים, למרות כמה שורות תאים לעשות להאריך תהליכים.
פרוטוקול מפורט של עכברוש נוירונים בהיפוקמפוס culturing באמצעות מערכת שיתוף תרבות תוארה בעבר 4,12,13. כאן אנו פרט פרוטוקול שונה מתאים נוירונים בקליפת המוח. כמו כ 20×10 6 תאים התאושש העובר כל עכברוש, שיטה זו שימושית במיוחד עבור ניסויים הדורשים כמויות גדולות של נוירונים (אך לא מודאג אוכלוסייה הומוגנית מאוד נוירונים). הכנת נוירונים גליה צריך להיות מתוכנן באופן ספציפי זמן. אנו נספק את פרוטוקול צעד אחר צעד עכברוש נוירונים בקליפת המוח culturing כמו גם בתאי גלייה culturing לתמוך נוירונים.
פרוטוקול זה מספק שיטה עכברוש נוירונים בקליפת המוח culturing העיקרי בנוכחות תאים גליה, תוך מתן אפשרות לתאי העצב להיות מבודד בקלות לניתוח ניסיוני. תמיכה גליה התפתחות פנוטיפ בריא העצבית, בעוד תגובות עצביות ויסות גם טיפולים ניסיוניים באופן רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. בנוסף, …
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים לחברי מעבדה קודמות שתרמו עידון של פרוטוקול זה, ה-NIH על התמיכה לאורך השנים (DA19808 ו DA15014 ל OM). אנה אבט 1 הוא עמית של "אימון המחקר הבינתחומי Translational ב neuroAIDS" (T32-MH078795), ולכן עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים תחת רות ל 'פרס Kirschstein הלאומית למחקר שירות 5T32MH079785.
Reagent | Concentration |
---|---|
Glucose | 16 mM |
Sucrose | 22 mM |
NaCl | 135 mM |
KCl | 5 mM |
Na2HPO4 | 1 mM |
KH2PO4 | 0.22 mM |
HEPES | 10 mM |
pH | 7.4 |
Osmolarity | 310±10 mOsm |
Table 1. Dissection Medium.
Reagent | Concentration |
---|---|
DMEM | 90% |
FBS | 10% |
Gentamicin | 50 μg/mL |
Tabe 2. Glia Plating Medium.
Reagent | Concentration |
---|---|
DMEM | 90% |
Horse Serum | 10% |
Table 3. Neuron Plating Medium.
Reagent | Concentration |
---|---|
DMEM | 98% |
N2 Supplement | 1% |
1M HEPES | 1% |
Ovalbumin | 50 mg/100mL |
Table 4. N2 Medium.
Reagent | Concentration |
---|---|
Boric Acid | 50 mM |
Sodium Borate | 12.5 mM |
Table 5. Borate Buffer (for poly-lysine).
Reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
High glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) |
Invitrogen | 11995-073 |
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat-inactivated | Hyclone | 26400-044 |
Horse Serum, Heat-inactivated | Hyclone | H1138 |
Gentamicin (50mg/mL) | Invitrogen | 15750-060 |
N2 Supplement (100x) | Invitrogen | 17502-048 |
HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 |
Albumin from chicken egg white, Grade VI (Ovalbumin) |
Sigma-Aldrich | A2512 |
2.5% Trypsin | Invitrogen | 15090-046 |
0.5% Trypsin-EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) |
Sigma-Aldrich | D-5025 |
Paraplast | Fisher | 12-646-106 |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1274 |
Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma-Aldrich | C6645 |
Stereomicroscope | Leica | Leica ZOOM 2000 |
Cover glasses, Circles, 15 mm, Thickness 0.13-0.17 mm |
Carolina | 633031 |
Thermanox sheets | Grace BioLabs | HS4550 |
Large forceps | Biomedical Investigación Instruments |
70-4000 |
Fine-tipped No.5 forceps | Fine Science Tools |
91150-20 |
Pattern No.1 forceps | Biomedical Investigación |
10-1400 |
Instruments | ||
Scissors, straight, sharp-blunt | Biomedical Investigación Instruments |
28-1435 |
Micro Dissecting scissors | Biomedical Investigación Instruments |
11-2070 |
Micro Dissecting Curved scissors | Biomedical Investigación Instruments |
11-1395 |