Une approche recombinaison Cre-Lox P pour la détection de la fusion cellulaire In Vivo</em
Summary
Une méthode pour suivre la fusion cellulaire dans les organismes vivants au cours du temps est décrite. L'approche utilise Cre-<em> LoxP</emRecombinaison> pour induire l'expression de luciférase après la fusion cellulaire. Le signal luminescent généré peut être détecté dans les organismes vivants en utilisant des systèmes d'imagerie bio photonique avec une sensibilité de détection de ~ 1000 cellules dans les tissus périphériques.
Abstract
La capacité de deux ou plusieurs cellules d'un même type de fusionner a été utilisé chez les métazoaires long de l'évolution de former de nombreux organes complexes, y compris le muscle squelettique, les os et le placenta. Les études contemporaines montrent la fusion de cellules du même type confère fonction améliorée. Par exemple, lorsque les cellules trophoblastiques du fusible du placenta pour former le syncytiotrophoblaste, le syncytiotrophoblaste est mieux en mesure de transporter les nutriments et les hormones à travers la barrière foeto-maternelle de trophoblastes non fusionnée 1-4. Des études plus récentes démontrent la fusion de cellules de différents types peuvent diriger le destin des cellules. Le "retour" ou la modification du destin cellulaire par fusion était autrefois considérée comme limitée aux systèmes de culture cellulaire. Mais l'avènement de la transplantation de cellules souches conduit à la découverte par nous et d'autres que les cellules souches peuvent fusionner avec les cellules somatiques in vivo et que la fusion facilite la différenciation des cellules souches 5-7. Ainsi, la fusion cellulaire est un processus réglementé capable de promouvoir la survie et la différenciation cellulaire et pourrait donc être d'une importance centrale pour le développement, la réparation des tissus et même la pathogénie de la maladie.
Limiter l'étude de la fusion cellulaire, est le manque de technologie appropriée pour 1) identifier précisément les produits de fusion et à 2) des produits de fusion suivre dans le temps. Nous présentons ici une nouvelle approche pour répondre à la fois les limites via l'induction de la bioluminescence lors de la fusion (figure 1);. Bioluminescence peuvent être détectés avec une haute sensibilité in vivo 8-15 Nous utilisons une construction codant pour la luciférase de luciole (Photinus pyralis) gène placé à côté de un codon stop flanqué de séquences LoxP. Lorsque les cellules exprimant ce gène avec fusible de cellules exprimant la protéine recombinase Cre, les sites loxP sont clivés et le signal d'arrêt est excisé permettant la transcription de la luciférase. Parce que le signal est inducibles, l'incidence des faux positifs signaux est très faible. Contrairement aux méthodes existantes qui utilisent le système Cre / LoxP 16, 17, nous avons intégré un signal «vivant» de détection et ainsi permettre pour la première fois la possibilité de suivre la cinétique de la fusion cellulaire in vivo.
Afin de démontrer l'approche, les souris exprimant la recombinase Cre omniprésent servi en tant que bénéficiaires des cellules souches transfectées avec une construction d'exprimer la luciférase en aval d'un codon stop floxés. Les cellules souches ont été transplantés par injection intra-myocardique et après analyse de transplantation d'image intravitale a été menée pour vérifier la présence des produits de fusion dans le cœur et les tissus environnants au cours du temps. Cette approche pourrait être adaptée pour analyser la fusion cellulaire dans n'importe quel type de tissu, à tout stade de développement, la maladie ou la réparation des tissus adultes.
Protocol
Discussion
La méthode décrite ici permet, pour la première fois, l'identification et l'analyse temporelle discrète de la fusion cellulaire dans les organismes, y compris les petits animaux. L'approche combine Cre-LoxP de recombinaison avec l'analyse d'image ultérieures biophotonique. L'approche est susceptible d'être suivi non seulement fusion cellule-cellule, mais aussi fusion virus-cellule et ainsi pourraient se révéler utiles pour le suivi des infections virales. L'analyse des images est …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Peiman Hemmati (Département de médecine, Université de Wisconsin-Madison) pour avoir généreusement fourni les MSC H1, et le Dr Tim Hacker, le Dr Song et Gouqing Mme Jill Koch de l'Université du Wisconsin physiologie cardiovasculaire Facilité de base pour les opérations chirurgicales de la souris. Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation grâce à une bourse de recherche supérieures à Brian Freeman et NIH R21 HL089679.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Neon Transfection System | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK5000 | |
| Neon 100 μL Kit | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK10025 | Contains R and E Buffer |
| a-MEM powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12000-022 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone, Logan UT | SH30070.03 | |
| B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 006054 | |
| Trypsin 10X | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | MT-25-054-Cl | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | 25030-081 | |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | 122796 | |
| Xenogen Biophotonic Imaging System | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | IVIS Spectrum | |
| Sodium Biocarbonate | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | S6014-500G | |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11140-050 |
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