A Cre-Lox Abordagem Recombinação P para Detecção de fusão celular In Vivo</em
Summary
Um método para controlar a fusão de células de organismos vivos ao longo do tempo é descrito. A abordagem utiliza Cre-<em> LoxP</emRecombinação> para induzir a expressão luciferase sobre fusão celular. O sinal luminoso gerado pode ser detectado nos organismos vivos utilizando sistemas de imagens biofotônica com uma sensibilidade de detecção de ~ 1.000 células nos tecidos periféricos.
Abstract
A capacidade de duas ou mais células do mesmo tipo para fundir tem sido utilizado em metazoários ao longo da evolução para formar muitos órgãos complexos, incluindo o músculo esquelético, ossos e placenta. Estudos contemporâneos demonstram fusão de células do mesmo tipo confere função melhorada. Por exemplo, quando as células do trofoblasto do fusível placenta para formar o sinciciotrofoblasto, o sinciciotrofoblasto é mais capaz de transportar nutrientes e hormônios através da barreira materno-fetal do trofoblasto não fundido 1-4. Estudos mais recentes demonstram a fusão de células de diferentes tipos pode direcionar o destino da célula. A "reversão" ou modificação do destino da célula por fusão já foi pensado para ser limitada a sistemas de cultura de células. Mas o advento do transplante de células-tronco levou à descoberta por nós e outras que as células-tronco podem se fundir com as células somáticas in vivo e que a fusão facilita a diferenciação de células-tronco 5-7. Assim, fusão celular é um processo regulado capable de promover a sobrevivência e diferenciação celular e, portanto, poderia ser de importância central para o reparo, o desenvolvimento de tecidos e até mesmo a patogênese da doença.
Limitar o estudo da fusão celular, é a falta de tecnologia apropriada a 1) identificar com precisão produtos de fusão e 2) produtos de fusão faixa ao longo do tempo. Aqui apresentamos uma nova abordagem para abordar tanto limitações através da indução de bioluminescência em fusão (Figura 1);. Bioluminescência pode ser detectado com alta sensibilidade in vivo 15/08 Nós utilizamos uma construção que codifica a luciferase do firefly (Photinus pyralis) gene colocado adjacente ao um códon de parada flanqueado por seqüências LoxP. Quando as células expressando este gene fusível com células expressando a proteína Cre recombinase, os sites são clivados e LoxP o sinal de parada é retirado permitindo a transcrição de luciferase. Como o sinal é inducible, a incidência de falsos-positivos sinais é muito baixa. Ao contrário dos métodos já existentes, que utilizam o sistema Cre / LoxP 16, 17, foi incorporado um "viva" sinal de detecção e, assim, pagar pela primeira vez a oportunidade de acompanhar a cinética de fusão celular in vivo.
Para demonstrar a abordagem, os camundongos ubiquitously expressar Cre recombinase serviu como receptores de células-tronco transfectadas com uma construção para expressar a jusante luciferase de um códon de parada floxed. Células-tronco foram transplantadas via injeção intramiocárdica e depois do transplante de análise de imagem intravital foi conduzido para rastrear a presença de produtos de fusão no coração e tecidos circundantes ao longo do tempo. Esta abordagem pode ser adaptada para analisar fusão celular em qualquer tipo de tecido, em qualquer estágio da doença, desenvolvimento ou reparação de tecidos adultos.
Protocol
Discussion
O método descrito aqui permite, pela primeira vez, a identificação discreta e análise temporal da fusão celular em organismos, incluindo animais de pequeno porte. A abordagem combina Cre-LoxP recombinação com análise de imagem subseqüentes biofotônica. A abordagem é passível de rastreamento não só a fusão célula-célula, mas também do vírus na célula-fusion e assim pode ser útil para rastrear infecções virais. Análise de imagem é rápida e é possível de várias imagens de pequenos animais simul…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Peiman Hemmati (Departamento de Medicina da Universidade de Wisconsin-Madison) para oferecer generosamente as CTMs H1, e Dr. Hacker Tim, Dr. Gouqing Song e Ms. Jill Koch, da Universidade de Wisconsin Fisiologia Cardiovascular Facilidade núcleo para realização de cirurgias mouse. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation através de uma Bolsa de Investigação Pós-Graduação de Brian Freeman e R21 NIH HL089679.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Neon Transfection System | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK5000 | |
| Neon 100 μL Kit | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK10025 | Contains R and E Buffer |
| a-MEM powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12000-022 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone, Logan UT | SH30070.03 | |
| B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 006054 | |
| Trypsin 10X | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | MT-25-054-Cl | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | 25030-081 | |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | 122796 | |
| Xenogen Biophotonic Imaging System | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | IVIS Spectrum | |
| Sodium Biocarbonate | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | S6014-500G | |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11140-050 |
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