העכברים הטרנסגניים להיות שימושי מאוד ייחוס תפקיד פיזיולוגי ל הגנים. כמו מחקר, כגון בכלל, מחקרים תפקודיות של דרכי הנשימה, במיוחד, עברו שינוי מדהים לכיוון מודלים Murine. כאן אנו מספקים פרוטוקולים<em> במבחנה</em> מחקרים קנה הנשימה התכווצות כדי להעריך את תפקוד השריר החלק בדרכי הנשימה murine.
מהונדס לבין עכברים בנוקאאוט היו כלים רבי עוצמה לחקר הפיזיולוגיה ו פתופיזיולוגיה של דרכי הנשימה 1,2. ב tensometry חוץ גופית ההכנות לקנה הנשימה מבודדים הוכיחה להיות שימושי assay של השריר החלק בדרכי הנשימה (ASM) בתגובה כויץ בעכברים מהונדסים גנטית. אלה בהכנות חוץ גופית לקנה הנשימה הם פשוטים יחסית, לתת מענה חזקים, ולשמור את שני קצות העצבים הכולינרגית תפקודית ותגובות שרירים, גם לאחר incubations ארוכים.
Tensometry קנה הנשימה מספקת גם assay תפקודית ללמוד מגוון רחב של השני איתות המסלולים שליח המשפיעות על התכווצות של שריר חלק. התכווצות של קנה הנשימה מתווכת בעיקר על ידי, העצבים הפאראסימפתטית כולינרגית המשחררים אצטילכולין על ASM (איור 1). קולטני אצטילכולין ASM הגדולים הם M2 ו M3 muscarinic שהם G I / O ו GQ קולטנים מצמידים, בהתאמה <sup> 3,4,5. רצפטורים M3 לעורר התכווצות ידי צימוד כדי GQ להפעיל phospholipase C, IP3 גידול הייצור IP3 בתיווך לשחרור סידן reticulum sarcoplasmic 3,6,7. M2 / G I / O איתות הוא האמין כדי לשפר את הצירים על ידי עיכוב של cyclase adenylate מובילה לירידה ברמות הסכמי קמפ 5,8,9,10. מסלולים אלה מהווים את מה שנקרא "pharmaco-התכווצות צימוד" של השריר החלק בדרכי הנשימה 11. בנוסף, איתות כולינרגית באמצעות קולטנים מסוג M2 (ו מווסתת על ידי איתות M3) כוללת מסלולים depolarize ASM אשר בתורו להפעיל מסוג L, מתח תלויי תעלות סידן (איור 1) ואת זרימת סידן (מה שנקרא "עירור-התכווצות צימוד" ) 4,7. סקירות מפורטות יותר על איתות המסלולים השליטה היצרות דרכי הנשימה ניתן למצוא 4,12. המסלולים הנ"ל נראה כי שימור בין עכברים ומינים אחרים. עם זאת, וקנה הנשימה עכבר שונים מינים אחרים אניn חלק איתות המסלולים. הבולט ביותר הוא חוסר התגובה כויץ ל 13,14 ו היסטמין אדנוזין, שניהם ידועים מאפננים ASM בבני אדם ומינים אחרים 5,15.
כאן אנו מציגים פרוטוקולים הבידוד של טבעות לקנה הנשימה של Murine ואת במדידה חוץ גופית התפוקה כויץ שלהם. כללו תיאורים של תצורת ציוד, בידוד קנה הנשימה טבעת ומדידות ההתכווצות. דוגמאות ניתנות לעורר התכווצויות בעקיפין באמצעות גירוי אשלגן גבוהה של עצבים ישירות על ידי שלילת קוטביות של שריר ASM להפעיל מתח תלוי זרם סידן (1. גבוהה K +, איור 1). בנוסף, שיטות מוצגים גירויים של העצבים לבד באמצעות גירוי שדה חשמלי (2. EFS, איור 1), או גירוי ישיר של השריר ASM באמצעות מוליך עצבי אקסוגני להחיל אמבטיה (3. אקסוגני אח, איור 1). זה flexibility וקלות ההכנה הופך את המודל טבעת מבודדת קנה הנשימה assay חזק ומתפקד במשך מספר איתות מפלי המעורבים התכווצות שרירים דרכי הנשימה חלקה.
הפרוטוקול המובא כאן מספק הכנה פיזיולוגית להערכת תפקוד דרכי הנשימה השריר. אנו פועלים בדרך כלל 3-4 אמבטיה ההכנות איברים בו זמנית, לעומת זאת, מערכות ארוזים מראש זמינים ממספר ספקים המאפשרים מדידה בו זמנית של עד 8 ההכנות (ADInstruments, דיוק מכשירים בעולם, ומכשירים הרווארד). ניצלנ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי מענק מטעם המרכז לחקר חדשנות מניעה וטיפול במחלות דרכי הנשימה, NINDS מענק (NS052574), ומתוך התוכנית סנדלר לחקר אסטמה.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Analogue-Digital Converter | ADInstruments | PowerLab 4/35 | |
Carbachol (Carbamoylcholine Chloride) | Sigma-Aldrich | C4832 | 10-2 M in water (aliquots can be stored at -20°C) |
Charting Software | ADInstrtuments | LabChart | |
Heating Circulator | Haake | Mixer Mill MM400 | |
Isometric Force Transducer | Kent Scientific | TRN001 | |
Stimulator | Grass Technologies | S88 Dual Output Square Pulse Stimulator | |
Tissue Bath | WPI | 47264 |