Fare kullanarak Trakeal Konstrüksiyon in vitro ölçümleri ise
Summary
Transgenik farelerin genleriyle fizyolojik fonksiyonu atfedilmesi de son derece yararlı olmuştur. Genel olarak böyle, araştırma ve hava yolunun fonksiyonel çalışmalar gibi, özellikle, sıçan modellerinde doğru dikkate değer bir değişim geçirmiş. Burada protokolleri sağlamak<em> In vitro</em> Trakea daralması çalışmalarda fare hava yolu düz kas fonksiyonunu değerlendirmek için.
Abstract
Transgenik ve knockout farelerde havayolu 1,2 fizyolojisi ve patofizyolojisi soruşturma için güçlü araçlar olmuştur. Izole trakea preparatlarında in vitro tensometry olarak havayolu düz kas (ASM) genetiği değiştirilmiş farelerde kontraktil yanıt yararlı bir test olduğu kanıtlanmıştır. In vitro trakea preparatlarında Bu nispeten basit, sağlam bir yanıt sağlamak ve fonksiyonel kolinerjik sinir uçlarını ve kas yanıtları, hatta uzun inkubasyon sonrasında korurlar.
Trakeal tensometry da düz kas kasılması etkileyen ikincil haberci sinyal yolunun çeşitli çalışmak için işlevsel bir test sağlar. Trakeada daralma başta ASM (Şekil 1) üzerine asetilkolin serbest olduğunu parasempatik kolinerjik sinirler aracılığıyla olur. Büyük ASM asetilkolin reseptörlerini sırasıyla G i / o ve Gq reseptörler vardır muskarinik M2 ve M3 olan <sup> 3,4,5. M3 reseptörleri fosfolipaz C, sarkoplazmik retikulum 3,6,7 gelen artış IP3 üretim ve IP3 aracılı kalsiyum salınımını aktive Gq için kaplin tarafından daralma çağrıştırıyor. M2 / G i / o sinyalizasyon cAMP düzeyleri 5,8,9,10 bir azalmaya yol adenilat siklaz inhibisyonu ile kasılmaları kazandırdığı düşünülmektedir. Bu yollar, hava yolu düz kas 11 sözde "farmakoekonomi daralma kaplin" oluşturmaktadır. Buna ek olarak, M2 reseptörleri ile kolinerjik sinyalleşme (ve M3 sinyal ile modüle) sırasıyla L-tipi, Gerilime-bağlı kalsiyum kanalları (Şekil 1) ve bu nedenle "eksitasyon-kasılması kuplaj" olarak adlandırılan kalsiyum girişini (aktive olan ASM depolarize yolları içerir ) 4,7. Havayollarındaki konstriksiyon kontrol sinyal yolları hakkında daha detaylı değerlendirme 4,12 bulunabilir. Yukarıdaki yolları fare ve diğer türler arasındaki korunacak görünür. Ancak, fare tracheas diğer türlerden farklı in Biraz sinyal yolları. En önemli histamin ve adenozin 13,14 ile kasılma cevapları, insan ve diğer türler 5,15 hem tanınmış ASM modülatörleri onların eksikliğidir.
Burada fare trakeal halkalar izolasyonu için protokoller ve kontraktil çıkışı in vitro ölçüm sunuyoruz. Dahil donanım konfigürasyonu açıklamaları vardır, trakea halkası izolasyonu ve kasılma ölçümleri. Örnekler voltaj bağımlı kalsiyum girişini etkinleştirmek için, yüksek potasyum sinirlerin uyarımı ve doğrudan ASM kas depolarizasyon kullanarak dolaylı kasılmaları çağrıştıran için verilmiştir (1. Yüksek K +, Şekil 1). Buna ek olarak, yöntemleri elektrik alanı stimülasyonu (2. EFS, Şekil 1) eksojen nörotransmiter kullanılarak ASM kas, ya doğrudan uyarılması banyosunda (3. Eksojen Ach, Şekil 1) ile tek başına uygulandığında sinirlerin uyarılara için sunulmuştur. Bu dsyaxibility ve hazırlama kolaylığı izole trakea halkası modeli havayolu düz kas kasılmasına yer çağlayanlar sinyal bir dizi için sağlam ve fonksiyonel testi vermektedir.
Protocol
Discussion
Burada sunulan protokol yolu kas fonksiyonunu değerlendirmek için fizyolojik bir hazırlık sağlar. Biz genellikle aynı anda 3-4 organı banyo müstahzarları faaliyet Ancak, paketlenmiş sistemleri 8 preparatları (ADInstruments, Dünya Hassas Aletler ve Harvard Apparatus) kadar eş zamanlı ölçümler izin tedarikçileri bir dizi edinilebilir. Biz eşdeğer sonuçları ile kuvvet dönüştürücüler ve doku organ banyolarına bir dizi kullanmış olurlar. Ancak, elektrik alan stimülasyonu uyarıcı elektrotlar …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Önleme Yenilik Merkezi ve Havayolu Hastalıkları, NINDS hibe (NS052574), Tedavi gelen ve Astım Araştırma Sandler Programı bir hibe ile finanse edildi.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Analogue-Digital Converter | ADInstruments | PowerLab 4/35 | |
| Carbachol (Carbamoylcholine Chloride) | Sigma-Aldrich | C4832 | 10-2 M in water (aliquots can be stored at -20°C) |
| Charting Software | ADInstrtuments | LabChart | |
| Heating Circulator | Haake | Mixer Mill MM400 | |
| Isometric Force Transducer | Kent Scientific | TRN001 | |
| Stimulator | Grass Technologies | S88 Dual Output Square Pulse Stimulator | |
| Tissue Bath | WPI | 47264 |
Referencias
- Lloyd, C. M. Building better mouse models of asthma. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 231-236 (2007).
- Hausding, M., Sauer, K., Maxeiner, J. H., Finotto, S. Transgenic models in allergic responses. Curr. Drug Targets. 9, 503-510 (2008).
- Eglen, R. M., Hegde, S. S., Watson, N. Muscarinic receptor subtypes and smooth muscle function. Pharmacol Rev. 48, 531-565 (1996).
- Ehlert, F. J. Contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in gastrointestinal, airway and urinary bladder smooth muscle. Life Sci. 74, 355-366 (2003).
- Hall, I. P. Second messengers, ion channels and pharmacology of airway smooth muscle. Eur. Respir. J. 15, 1120-1127 (2000).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Ehlert, F. J. Pharmacological analysis of the contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in smooth muscle. Receptors Channels. 9, 261-277 (2003).
- Sankary, R. M., Jones, C. A., Madison, J. M., Brown, J. K. Muscarinic cholinergic inhibition of cyclic AMP accumulation in airway smooth muscle. Role of a pertussis toxin-sensitive protein. Am. Rev. Respir Dis. 138, 145-150 (1988).
- Widdop, S., Daykin, K., Hall, I. P. Expression of muscarinic M2 receptors in cultured human airway smooth muscle cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9, 541-546 (1993).
- Karaki, H. Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle. Pharmacol. Rev. 49, 157-230 (1997).
- Somlyo, A. V., Somlyo, A. P. Electromechanical and pharmacomechanical coupling in vascular smooth muscle. J. Pharmacol Exp. Ther. 159, 129-145 (1968).
- Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Muscarinic receptors and control of airway smooth muscle. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158, 154-160 (1998).
- Fernandez-Rodriguez, S., Broadley, K. J., Ford, W. R., Kidd, E. J. Increased muscarinic receptor activity of airway smooth muscle isolated from a mouse model of allergic asthma. Pulm. Pharmacol. Ther. 23, 300-307 (2010).
- Garssen, J., Loveren, H. V. a. n., Van Der Vliet, H., Nijkamp, F. P. An isometric method to study respiratory smooth muscle responses in mice. J. Pharmacol. Methods. 24, 209-217 (1990).
- Vass, G., Horvath, I. Adenosine and adenosine receptors in the pathomechanism and treatment of respiratory diseases. Curr. Med. Chem. 15, 917-922 (2008).
- Borchers, M. T. Methacholine-induced airway hyperresponsiveness is dependent on Galphaq signaling. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 285, 114-120 (2003).
- Sausbier, M. Reduced rather than enhanced cholinergic airway constriction in mice with ablation of the large conductance Ca2+-activated K+ channel. Faseb. J. 21, 812-822 (2007).
- Scheerens, H. Long-term topical exposure to toluene diisocyanate in mice leads to antibody production and in vivo airway hyperresponsiveness three hours after intranasal challenge. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 159, 1074-1080 (1999).
- Kenakin, T. P. . A pharmacology primer : theory, applications, and methods. , (2009).
- Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. BK Channel {beta}1 Subunits Regulate Airway Contraction Secondary to M2 Muscarinic Acetylcholine Receptor Mediated Depolarization. J. Physiol. , 1803-1817 (2011).
- Moffatt, J. D., Cocks, T. M., Page, C. P. Role of the epithelium and acetylcholine in mediating the contraction to 5-hydroxytryptamine in the mouse isolated trachea. Br. J. Pharmacol. 141, 1159-1166 (2004).
- Bachar, O., Adner, M., Uddman, R., Cardell, L. O. Nerve growth factor enhances cholinergic innervation and contractile response to electric field stimulation in a murine in vitro model of chronic asthma. Clin. Exp. Allergy. 34, 1137-1145 (2004).
- Weigand, L. A., Myers, A. C., Meeker, S., Undem, B. J. Mast cell-cholinergic nerve interaction in mouse airways. J. Physiol. 587, 3355-3362 (2009).
- Kao, J., Fortner, C. N., Liu, L. H., Shull, G. E., Paul, R. J. Ablation of the SERCA3 gene alters epithelium-dependent relaxation in mouse tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. 277, 264-270 (1999).
- Krane, C. M. Aquaporin 5-deficient mouse lungs are hyperresponsive to cholinergic stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 14114-14119 (2001).
- Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. BK channel beta1-subunit regulation of calcium handling and constriction in tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 291, L802-L810 (2006).
- Fortner, C. N., Breyer, R. M. EP2 receptors mediate airway relaxation to substance P ATP, and PGE2. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, 469-474 (2001).
- Hay, D. W. Differential modulation of endothelin ligand-induced contraction in isolated tracheae from endothelin B (ET(B)) receptor knockout mice. Br. J. Pharmacol. 132, 1905-1915 (2001).
- Stengel, P. W., Yamada, M., Wess, J., Cohen, M. L. M(3)-receptor knockout mice: muscarinic receptor function in atria, stomach fundus, urinary bladder, and trachea. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol. 282, R1443-R1449 (2002).
- Trevisani, M. Evidence for in vitro expression of B1 receptor in the mouse trachea and urinary bladder. Br. J. Pharmacol. 126, 1293-1300 (1038).
- Mehats, C. PDE4D plays a critical role in the control of airway smooth muscle contraction. FASEB J. 17, 1831-1841 (2003).
- Kumar, R. K., Herbert, C., Foster, P. S. The “classical” ovalbumin challenge model of asthma in mice. Curr. Drug Targets. 9, 485-494 (2008).
