Reprogrammation des cellules somatiques humaines dans cellules souches pluripotentes induites (CISP) Utilisation vecteur rétroviral avec la GFP

Summary

Une méthode pour générer de l'homme cellules souches pluripotentes induites (CISP) via un rétrovirus médiation expression ectopique de OCT4, SOX2, KLF4 et MYC est décrite. Un moyen pratique pour identifier l'homme colonies iPSC fondées sur l'expression de GFP est également discuté.

Abstract

Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont pluripotentes et une source précieuse pour cellulaires dans la modélisation des maladies in vitro et la médecine régénérative ^1. Il a été montré précédemment que des cellules somatiques humaines peuvent être reprogrammées pour la pluripotence par l'expression ectopique de quatre facteurs de transcription (Oct4, Sox2, Klf4 et Myc) et devenir cellules souches pluripotentes induites (CISP) ^2-4. Comme les CSEh, CSPi humaines sont pluripotentes et une source potentielle de cellules autologues. Nous décrivons ici le protocole de reprogrammer des cellules de fibroblastes humains avec les quatre facteurs de reprogrammation clonés dans GFP-rétroviral contenant un squelette ^4. En utilisant le protocole suivant, nous générons CSPi de l'homme dans les 3-4 semaines dans des conditions de culture des CSE humaines. Homme colonies iPSC ressemblent CSEh dans la morphologie et afficher la perte de la GFP de fluorescence en résultat de l'inactivation transgène rétroviral. colonies isolées iPSC mécaniquement sous un microsco fluorescencepe se comporter de la même façon que les CSEh. Dans ces cellules, nous avons détecter l'expression de multiples gènes de pluripotence et des marqueurs de surface.

Protocol

1. Reprogrammation par rétrovirus exprimant les facteurs de reprogrammation Des fibroblastes humains sont cultivées dans un milieu des fibroblastes (10% de FBS dans DMEM avec Pen / Strep). Un jour avant l'infection, la plaque de 1×10 5 fibroblastes humains dans un puits d'une plaque à 6 puits. Aspirer à moyen et à éliminer les cellules mortes et ajoutez 2 ml de milieu de fibroblastes frais. Ajouter du sulfate de protamine à une concentration finale de 5 ng / ml. <…

Discussion

L'expression de facteurs de transcription quatre fibroblastes humains à la reprogrammation des CSPi. De nombreuses tentatives ont été faites pour produire des CSPi humaines en utilisant des approches non-intégration ou non-génétiques pour générer CSPi cliniquement sûres. Jusqu'à présent, ces méthodes montrent l'efficacité très faible et nécessitent une optimisation plus poussée pour améliorer la reproductibilité ^11-14. Rétro-méthodes ou lentiviral sont facilement utilisée pour…

Materials

Name	Concentration	Company	Catalogue Number
hESC medium
DMEM/F12	80%	Invitrogen	11330057
Knockout Serum Replacer	20%	Invitrogen	10828-028
L-Glutamine (200 mM)	2 mM	Invitrogen	25030081
Nonessential Amino Acids (10 mM)	0.1 mM	Invitrogen	11140050
β-Mercaptoethanol (14.3 M) or MTG	0.1 mM	Invitrogen	M-6250
bFGF-2 10 μg/ml	4 ng/ml	GIBCO/BRL	GF003AF
Penicillin/Streptomycin	1%	Millipore	15140-122
Fiboblasts Medium
DMEM	90%	Invitrogen	11965118
FBS	10%	Invitrogen	10407028
Penicillin/Streptomycin	1%	Millipore	15140-122

Table 1. Culture Medium

Name	Concentration	Company	Catalogue Number
Antibodies
OCT4	1:500	Abcam	Ab19857
SSEA3	1:100	Milipore	MAB4303
SSEA4	1:100	BD Biosciences	BD560218
Tra-1-81	1:100	BD Biosciences	BD560173
Tra-1-60	1:100	BD Biosciences	BD560174
NANOG	1:500	Abcam	Ab21624
Alexa-Flur 488	1:1000	Invitrogen	A11008
Alexa-Flur 555	1:1000	Invitrogen	A21422
DAPI	1:5000	Invitrogen	D1306
Plasmids
pMIG-OCT4		Addgene	17225
pMIG-SOX2		Addgene	17226
pMIG-KLF4		Addgene	17227
pMIG-MYC		Addgene	18119
Other Materials
Collagenase type IV	1mg/ml	Invitrogen	17104019
Gelatin, Porcine	0.1%	Sigma	G 1890
Triton	0.2%	Sigma	X100-500ML
Paraformaldehyde	4%	Sigma	47608
BSA	3%	American Bioanalytical	AB01800
MEF feeder cells		Millipore	PMEF-N
Cell Lifter		Corning	3008
Equipment
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter

Table 2. Reagents and equipment.