GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

Summary

OCT4 bir retrovirüs-aracılı ektopik ifadesi ile insan kaynaklı hücreler pluripotent kök (iPSCs) üretmek için bir yöntem olup, SOX2, KLF4 ve MYC tarif edilmektedir. GFP dayanarak insan iPSC koloniler tespit etmek pratik bir yolu da tartışılmaktadır.

Abstract

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) pluripotent ve in vitro hastalığı modelleme ve rejeneratif tıp ¹ de için paha biçilmez bir hücresel kaynaklarıdır. Daha önce insan somatik hücre dört transkripsiyon faktörlerinin ektopik ifade (Oct4, Sox2, Klf4 ve Myc) tarafından pluripotency yeniden yapılandırılabilir ve uyarılan pluripotent kök hücreler (iPSCs) ^2-4 olabildiği gösterilmiştir. HESC gibi, insan iPSCs pluripotent ve otolog hücre için potansiyel bir kaynaktır. Burada GFP içeren retroviral omurgası ⁴ klonlanmış dört yeniden programlama faktörleri ile insan fibroblast hücreleri yeniden programlamayı protokolü tanımlar. Aşağıdaki protokolü kullanarak, insan ESC kültür koşullarında 3-4 hafta içerisinde insan iPSCs oluşturur. İnsan iPSC koloniler yakından morfolojisi hESC benzeyen ve retroviral transgen susturulması bir sonucu olarak GFP flöresanı kaybı gösterir. iPSC koloniler bir floresan microsco altında mekanik olarak izolepe hESC gibi benzer bir şekilde davranırlar. Bu hücreler, biz çok pluripotency genlerin ve yüzey belirteçleri ifadesi algılar.

Protocol

1. Yeniden programlanması Faktörler ifade Retrovirus tarafından yeniden programlama İnsan fibroblastlar fibroblast ortamı (10% Pen / Strep ile DMEM içinde FBS) kültürlenmiştir. 6-iyi plaka iyi birine enfeksiyonu bir gün önce, plaka 1×10 5 insan fibroblastları. Ölü hücreleri çıkarmak ve taze fibroblast orta 2 ml eklemek için orta aspire. 5 ug / ml 'lik nihai bir konsantrasyon protamin sülfat ekleyin. Dikkatli bir enfeksiyon çokluğu (İçişleri …

Discussion

IPSCs dört transkripsiyon faktörleri reprograms insan fibroblast Anlatım. Pek çok klinik deneme güvenli iPSCs üretmek için non-entegre olan ya da olmayan genetik yaklaşım kullanılarak insan iPSCs üretmek için yapılmıştır. Şimdiye kadar, bu yöntemler son derece düşük verimlilik göstermek ve tekrarlanabilirlik ^11-14 geliştirmek için daha fazla optimizasyon gerektirir. Retro-ya lentiviral yöntemlerle kolayca elde ve viral entegrasyon kaynaklanan sorunları emniyet az bağımlı olan …

Materials

Name	Concentration	Company	Catalogue Number
hESC medium
DMEM/F12	80%	Invitrogen	11330057
Knockout Serum Replacer	20%	Invitrogen	10828-028
L-Glutamine (200 mM)	2 mM	Invitrogen	25030081
Nonessential Amino Acids (10 mM)	0.1 mM	Invitrogen	11140050
β-Mercaptoethanol (14.3 M) or MTG	0.1 mM	Invitrogen	M-6250
bFGF-2 10 μg/ml	4 ng/ml	GIBCO/BRL	GF003AF
Penicillin/Streptomycin	1%	Millipore	15140-122
Fiboblasts Medium
DMEM	90%	Invitrogen	11965118
FBS	10%	Invitrogen	10407028
Penicillin/Streptomycin	1%	Millipore	15140-122

Table 1. Culture Medium

Name	Concentration	Company	Catalogue Number
Antibodies
OCT4	1:500	Abcam	Ab19857
SSEA3	1:100	Milipore	MAB4303
SSEA4	1:100	BD Biosciences	BD560218
Tra-1-81	1:100	BD Biosciences	BD560173
Tra-1-60	1:100	BD Biosciences	BD560174
NANOG	1:500	Abcam	Ab21624
Alexa-Flur 488	1:1000	Invitrogen	A11008
Alexa-Flur 555	1:1000	Invitrogen	A21422
DAPI	1:5000	Invitrogen	D1306
Plasmids
pMIG-OCT4		Addgene	17225
pMIG-SOX2		Addgene	17226
pMIG-KLF4		Addgene	17227
pMIG-MYC		Addgene	18119
Other Materials
Collagenase type IV	1mg/ml	Invitrogen	17104019
Gelatin, Porcine	0.1%	Sigma	G 1890
Triton	0.2%	Sigma	X100-500ML
Paraformaldehyde	4%	Sigma	47608
BSA	3%	American Bioanalytical	AB01800
MEF feeder cells		Millipore	PMEF-N
Cell Lifter		Corning	3008
Equipment
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter

Table 2. Reagents and equipment.