איכות של fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) מוכתב על ידי זן הימני של העכבר כגון CF-1. Pluripotency, תומכת MEFs ומדיה ממוזגים (ס"מ) המתקבל אלה יכילו ריכוזים אופטימליים של Activin, שד ו Tgfβ1 הדרושים Activin / קטרי ו מסלולים FGF לשתף operatively לשמור על עצמי התחדשות pluripotency.
בדרך כלל, בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSCs) 1 יכול להיות מתורבת בתנאים משתנים. עם זאת, זה לא קל להקים מערכת יעילה culturing תאים אלה. מאז התנאים תרבות יכולה להשפיע על ביטוי גנים אשר מקנה pluripotency ב hESCs ו hiPSCs, אופטימיזציה וסטנדרטיזציה של השיטה תרבות הוא חיוני.
הקמת קווי hESC תוארה לראשונה על ידי שימוש MEFs כמו תאים מזין בסרום שור עוברית (FBS) המכיל בינוני התרבות 2. לאחר מכן, FBS הוחלף החלפת בנוקאאוט בסרום (KSR) ו FGF2, אשר משפר את הפצת hESCs 3. לבסוף, מזין ללא מערכות תרבות לאפשר תאים culturing על Matrigel מצופים צלחות ב-KSR המכיל אוויר בינוני (מדיום מותנה MEFs) 4. כתוצאה מכך, תנאי hESCs תרבות עברו לקראת תרבות מזין חופשית defin כימיתאד תנאים 5-7. יתר על כן, כדי למנוע אפשרות של זיהום על ידי פתוגנים וחלבונים מן החי באמצעות שיטות תרבות קסנו ללא רכיבים הוקמו 8.
כדי להשיג תנאים משופרים מזין תאים עכבר הוחלפו שורות תאים אנושיים (למשל שריר העובר ותאי עור 9, לתאי עור בוגרים 10, fibroblasts העורלה 11-12, תאים mesenchymal מי השפיר 13). עם זאת, היעילות של שמירה על hESCs שלא עברו התמיינות באמצעות העורלה האדם פיברובלסטים שמקורם שכבות מזין אינו גבוה כמו זה של מזין תאים העכבר בשל במפלס התחתון של הפרשת Activin 14. כמובן, יש הבדל ניכר ייצור גורם הגדילה של עכבר לתאי אדם מזין.
ניתוח של transcriptomes של עכבר לתאי מזין האדם גילה הבדלים משמעותיים בין תאים תומכים ולא תומכת. אקסוגני FGF2 חיונית maintaiנינג עצמית חידוש hESCs ו hiPSCs, ו זוהה כגורם מרכזי בוויסות ביטוי Tgfβ1, Activin ו שד (אנטגוניסט BMP) בתאים מזין. Activin הוכח לגרום ביטוי OCT4, Sox2, ו Nanog ב hESCs 15-16.
לתרבות לטווח ארוך, hESCs ו hiPSCs ניתן לגדל על MEFs מומת mitotically או מתחת מזין ללא תנאי MEF-CM (MEF אילף בינוני) על Matrigel מצופים צלחות כדי לשמור על מצב מובחן שלהם. ההצלחה של שני התנאים תרבות לחלוטין תלוי באיכות של תאים מזין, שכן הם משפיעים ישירות על הצמיחה של hESCs.
כאן, אנו מציגים שיטת אופטימיזציה עבור בידוד והתרבות של fibroblasts העכבר עובריים (MEFs), הכנת בינוני אוויר (ס"מ) האנזים צמוד immunosorbent assay (ELISA) כדי להעריך את רמות Activin בתוך התקשורת.
הליך הבידוד MEFs המוצגת כאן מאפשרת את הקמתה של מצב התרבות סטנדרטית hESCs ו hiPSCs. יתר על כן מערכת ELISA המבוסס משמש להערכת ייצור ציטוקינים על ידי התאים מזין הוא אינדיקטור שימושי לאיכות של MEF הנגזרות התקשורת ממוזגים. תחזוקה שוטפת של זן העכבר (CF1) מתן תמיכה fibroblasts יש להימנע אצווה אל אצווה וריאציה של התקשורת והתרבות. יתר על כן, מומלץ לבודד את העוברים מעכברים בו זמנית כדי להשיג איכות עקבית של תאים. אין ספק MEFs מבודד טרי אפשר לשמור קפוא ב P0 ו P1. MEFs מובטל כמו כן אפשר לשמור קפוא aliquots של כמויות מתאימות בהתאם לדרישות תרבית תאים. בדרך כלל כ 250.000 תאים יש מצופה היטב אחד של הצלחת 6 גם כדי hESCs התרבות תאים שב"ס. השיטה הוקמה אופטימיזציה ניתן להשתמש באופן שגרתי כדי לצמצם את השונות בין diffeלשכור ניסויים.
The authors have nothing to disclose.
תודה מיוחדת לד"ר בוריס גרבר להגדרת Activin פרוטוקול ELISA כפי שפורסם גרבר et al. 2007. אנו מודים במיוחד לגב 'מוניקה Shevack להכנת סקירה גרפית. אנו מודים מאוד ד"ר פוקס הייקו על כל העזרה והצעות ערך לפני ובמהלך הצילומים. ברצוננו להודות לכל אנשי המעבדה Adjaye, במיוחד אליזבת סוצ'ה לשמירה על אספקה קבועה של MEFs ו CM. כמו כן, אנו מכירים עמיתינו במתקן בעלי החיים של MPIMG לתמיכה הקבע שלהם. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מקס פלאנק, חברה [BMBF, מספר מענק 0315717A], השותפים של ERASysBio + היוזמה נתמכת במסגרת האיחוד האירופי ERA-NET פלוס תוכנית ב FP7.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM (High Glucose) | Gibco, Invitrogen | 41966-052 | |
FBS | Biochrom | S0115 | |
L-glutamine | Gibco, Invitrogen | 25030-024 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
Vacuum filter system | Corning | 431097 | 500 ml, 0.22 μm, PAS |
DMSO | Sigma | D2650 | |
Knockout DMEM | Gibco, Invitrogen | 10829-018 | |
Knockout Serum Replacement | Gibco, Invitrogen | 10828-028 | |
Non-Essential Amino Acids | Gibco, Invitrogen | 11140-035 | |
beta-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
PBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 100-18B | |
Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody | R&D Systems | BAM3381 | |
Gelatin | Sigma | G9391 | |
Human/Mouse/Rat Activin A MAb | R&D Systems | MAB3381 | |
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco, Invitrogen | 25300-054 | |
Extra Thin Iris Scissors | FST | 14088-10 | |
Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | |
Pierse Fixation Forceps | FST | 18155-13 |