Подготовка мышиных эмбриональных фибробластов подходит для культивирования эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клетках

Summary

Качество эмбриональных фибробластов мыши (MEFs) определяется по праву мышах, таких как CF-1. Плюрипотентности, поддерживающих MEFs и условных СМИ (CM), полученные из этих должен содержать оптимальные концентрации Активин, Gremlin и Tgfβ1, необходимых для Активин / Узловые и FGF пути к совместной оперативно поддерживать самообновления и плюрипотентности.

Abstract

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)¹ can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.

The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium². Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs³. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)⁴. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions^5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established⁸.

To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells⁹, adult skin cells¹⁰, foreskin fibroblasts^11-12, amniotic mesenchymal cells¹³). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A¹⁴. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.

Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgfβ1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs^15-16.

For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.

Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

Protocol

1. Выделение эмбриональных фибробластов мыши (MEFs) В следующих двух шагах выполняются, не связанных с асептических условиях. Пожертвуйте беременных мышей (CF1, Харлан, США) на 13 или 14 DPC (день после coitum) от шейки дислокации. Проанализируйте из рога матки, кратко промыть в 70% (объем / объем) этанола и место в трубку сокол содержащей PBS без Ca 2 + Mg 2 + (Gibco, Invitrogen). Следующие шаги осуществляются в капюшоне культуры ткани в асептических условиях и с помощью стерильных инструментов. Поместите рога матки в чашку Петри и отделить каждый эмбрион от плаценты и эмбриональных мешка. Проанализируйте головы и красных органов, умойся в PBS и поставить все эмбрионы в чистую чашку Петри. Мелко рубите ткани, используя стерильные лезвия, пока не станет возможным пипетки. Добавьте 1 мл 0,05% трипсин / EDTA (Gibco, Invitrogen), вклюДин 100 Куниц единиц ДНКазы I (USB), в зародыше. Передача ткани в 50 мл трубку сокол и инкубировать в течение 15 мин при 37 ° C. После каждых 5 мин инкубации клеток отделить с помощью пипетки вверх и вниз тщательно. Инактивируют трипсин, добавив около 1 объема свежеприготовленного MEF среды. MEF питательной среды (компоненты, чтобы сделать 500 мл средства массовой информации, смешать все компоненты и фильтр): 450 мл DMEM, 50 мл FBS (10% (об. /)), 5 мл 200 мМ L-глутамина (1/100 (V / V)), 5 мл пенициллина, стрептомицина (1/100 (V / V)). Центрифуга клеток с низкой скоростью (300 мкг), 5 мин, осторожно удалите супернатант и ресуспендируют осадок клеток в теплую среду MEF. Плиты приблизительно количество клеток, что эквивалентно 3-4 эмбрионов в каждом T150 (ТЭС) колбы покрыты 0,2% желатина (желатин из бычьей кожи, тип B, Sigma) в течение 2 часов. Фибробластов (P0, прохождение 0) являются единственными клетками, которые имеют возможность присоединить к желатин покрытием колбы. </lя> В идеале, клеток 80-90% сливной после 24 часов и на данном этапе большая часть P0 клеток замораживается для использования в будущем. Разверните оставшиеся T150 колбу (ы) P0 клетки до P3 и P4, то инактивировать и использовать в качестве питателей для replate ЭСК или для получения кондиционной среды (КС). 2. Инактивация и покрытие MEFs (подготовка фидерных клеток) Все этапы проводятся в капюшоне культуры ткани в асептических условиях. Пальто T150 колбы с 0,2% желатина и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов. Развести митомицина в PBS (1 мг / мл) и фильтр. Аспирируйте информации из MEFs и промыть PBS без Ca 2 + Mg 2 +. Место 20 мл среды, содержащей 10 мкг / мл митомицина на MEFs. Выдержите в течение 2 часов при температуре 37 ° С, митомицин С, содержащие средние затем промыть два раза PBS, trypsinize, центрифуга (в течение 5 мин при 300 мкг) и ресуспендирования клеток в теплой среде. Граф клеток и пластины с плотностью 56,000 клеток / см 2 в T150 колб и использовать для СМ производства на следующие 6 дней. 3. Условный средний (СМ) Подготовка Все этапы проводятся в капюшоне культуры ткани в асептических условиях. На следующий день после нанесения покрытия инактивированной MEFs при плотности 56,000 клеток / см 2 заменить MEF среде с чЭСК среды (UM, безусловный среды) (0,5 мл / см 2) дополнить недавно с 4 нг / мл FGF2. Соберите см от подачи колбы после 24 ч инкубации и добавить свежую среду чЭСК, содержащий 4 нг / мл FGF2 в кормушки. Повторите эту процедуру в течение последующих 6 дней. Каждый день магазин собрал CM при температуре -20 ° C. Через 6 дней смешать все порции средней и фильтр (Corning, 0,22 мкм, PAS). Сделайте 50 мл аликвоты и хранят при температуре -80 ° C. Дополнение CM с дополнительными 4 нг / мл FGF2 перед добавлением ЭСК выросли на Матригель. </ LI> 4. Измерение активин в кондиционированной среде (ИФА) 15 Доведите все образцы и реагенты до комнатной температуры. Развести захватить антител (Human \ Мыши \ Крыса Активин MAb, R & D Systems) в PBS с 1% BSA, добавить в планшет (100 мкл / лунку) и инкубировать в течение ночи при комнатной температуре. Через 24 часа промыть лунки три раза PBST (PBS с 0,05% Твин-20) (300 мкл / лунку), то блок (1% BSA / PBS, 300 мкл / лунку) в течение 1 часа при комнатной температуре. В это время подготовить Активин (R & D Systems) калибровочной кривой, в том числе 7 разведения (концентрация менее 30 нг / мл) и пустой образца. Линейный рабочий диапазон Активин между 0,25 и 32 нг / мл. Добавить дубликатов стандартов и образцов в лунки (100 мкл / лунку) и инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре. Вымойте скважин в три раза (300 мкл PBST). Добавить вторичных (биотинилированного) антител (человек / мышь / крыса биотинилированный Активин MAb, R & D Systems) (0.25 мкг / мл в 1% BSA / PBS) и инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре. Вымойте скважин в три раза (300 мкл PBST), добавьте стрептавидином-HRP (разводят в 1% BSA / PBS, R & D Systems) и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре. Вымойте скважин в три раза (300 мкл PBST), добавьте 100 мкл раствора субстрата (Quantikine, R & D Systems) и инкубировать 30 минут при комнатной температуре в темноте. Добавить 100 мкл стоп-раствора (Quantikine, R & D Systems) в каждую лунку и аккуратно перемешать. Установить микропланшетов читателя (Molecular Devices спектры Max 250, Global медицинской техники, Inc, штат Миннесота) до 450 нм, с длиной волны коррекции на 540 или 570 нм, определить оптическую плотность каждой лунки. 5. Представитель Результаты Общая схема выделения процедура представлена ​​на рисунке 1. Типичная морфология и ЭСК hiPSCs культивировали при различных условиях представлена ​​на рисунке 2. Морфология MEFs и инактивированных клеток фидерных использованы для подготовки CM представлена ​​на рисунке 3. В общем, камеры должны быть вырожденным 24 часов после изоляции и готова быть заморожены или расширена. Тем не менее, иногда это может занять 2-3 дня до получения сливной культур. СМ должны быть приготовлены из клетки при прохождении 4 и не позже. Это очень важно, потому что первичные клетки могут быть расширены за 4-5 проходов до начала старения. Цитокинов, Активин, рассматривается как наиболее важный фактор выделяется фидерных клеток для поддержки роста недифференцированных плюрипотентных клеток 14. Измерение уровня активин в см (рис. 4) представляет собой очень удобный количественного анализа для контроля качества MEFs. Рисунок 1. Схематическое изображение процедуры изоляции MEFs. Отправить по почте "> Рисунок 2. Типичная морфология недифференцированных ЭСК культивировали в присутствии (A) фидерных клеток (B) кондиционированной среды и (C) определенной среде. Типичная морфология hiPSCs культивировали в присутствии (D, E) клетки фидера. Рисунок 3. Типичная морфология эмбриональных фибробластов мыши (MEFs). () Прохождение 0 (P0) через два дня после покрытия / изоляции, (B) инактивированная слой подачи при плотности 56,000 клеток / см 2. Рисунок 4. Иммуноферментного анализа (ИФА) на основе измерения концентрации активин в кондиционированной среде (CM) пр.epared с мышиных эмбриональных фибробластов, полученных из CF1 штаммом мыши. CM была собрана в течение 6 дней, а затем объединяются. CM "1" и СМ "2" относятся к разным партиями средств массовой информации и единой для безусловного СМИ. В функции кондиционирования процесс активин секреции в среду на MEFs, Активин это практически невозможно обнаружить в UM.

Discussion

Процедура MEFs изоляции, представленные здесь позволяет создание стандартизированных условиях культуры ЭСК и hiPSCs. Кроме того, ИФА-системы, используемые для оценки продукции цитокинов фидерных клеток является полезным индикатором качества MEF-производных условно СМИ. Текущий ремонт мыши штамма (CF1) обеспечение поддержки фибробластов необходимо, чтобы избежать от партии к партии изменении медиа-культуры. Кроме того, рекомендуется изолировать от нескольких эмбрионов мышей одновременно получить стабильное качество клеток. Конечно свежевыделенных MEFs может быть заморожен на P0 и P1. Также инактивированной MEFs можно хранить в замороженном состоянии в аликвоты соответствующих сумм в зависимости от требований к клеточной культуре. Обычно около 250,000 клетки должны быть покрыты в одном и 6-луночного планшета для культуры ЭСК и иПК клеток. Создан и оптимизирован метод может быть широко используется, чтобы минимизировать изменчивость между Diff #Аренда экспериментов.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
DMEM (High Glucose)	Gibco, Invitrogen	41966-052
FBS	Biochrom	S0115
L-glutamine	Gibco, Invitrogen	25030-024
Penicillin-streptomycin	Gibco, Invitrogen	15140-122
Vacuum filter system	Corning	431097	500 ml, 0.22 μm, PAS
DMSO	Sigma	D2650
Knockout DMEM	Gibco, Invitrogen	10829-018
Knockout Serum Replacement	Gibco, Invitrogen	10828-028
Non-Essential Amino Acids	Gibco, Invitrogen	11140-035
beta-Mercaptoethanol	Sigma	M7522
PBS	Gibco, Invitrogen	14190-169
DNase I	Sigma	D4527
Mitomycin C	Roche	10107409001
Basic Fibroblast Growth Factor	PeproTech	100-18B
Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody	R&D Systems	BAM3381
Gelatin	Sigma	G9391
Human/Mouse/Rat Activin A MAb	R&D Systems	MAB3381
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco, Invitrogen	25300-054
Extra Thin Iris Scissors	FST	14088-10
Extra Fine Graefe Forceps	FST	11150-10
Pierse Fixation Forceps	FST	18155-13