Summary
NADPH oxidase is de belangrijkste bron van reactieve zuurstof species (ROS) in fagocyten. Vanwege de vluchtigheid van ROS is moeilijk te meten en te controleren ROS levels in levende dieren. Een minimaal invasieve methode voor seriële kwantificering van ROS in levende muizen beschreven.
Abstract
NADPH oxidase is een essentieel enzym dat antibacteriële en antifungale afweer medieert. Naast zijn rol in antimicrobiële afweer, NADPH oxidase verregaande signaalfuncties dat de ontstekingsreactie 1 moduleren. Aldus wordt de ontwikkeling van een meetmethode in "real-time" de kinetiek van NADPH oxidase afgeleide ROS productie verwacht een waardevol onderzoeksinstrument mechanismen relevant defensie, ontsteking en schade gastheer begrijpen.
Chronische granulomateuze ziekte (CGD) is een erfelijke aandoening van het NADPH oxidase gekenmerkt door ernstige infecties en overmatige ontsteking. Activering van de fagocyt NADPH oxidase heeft translocatie van de cytosolische subeenheden (p47 phox, p67 phox en p40 phox) en Rac een membraangebonden flavocytochrome (bestaande uit een Gp91 phox en p22 heterodimeer phox). Verliesvan functie mutaties in een van deze NADPH oxidase componenten resulteren in CGD. Vergelijkbaar met patiënten met CGD, Gp91 phox deficiënte muizen en p47 phox deficiënte muizen defect fagocyt NADPH oxidase activiteit en verminderde afweer 13, 14. Naast fagocyten die de NADPH oxidase bovenbeschreven componenten bevatten, een verscheidenheid aan andere celtypen expressie verschillende isovormen van NADPH oxidase.
Hier beschrijven we een werkwijze voor ROS productie kwantificeren levende muizen en de bijdrage van NADPH oxidase van ROS productie in modellen voor ontsteking en schade bakenen. Deze methode is gebaseerd op ROS reactie met L-012 (een analoog van luminol) om luminescentie die wordt geregistreerd door een charge-coupled device (CCD) uitstoten. In de oorspronkelijke beschrijving van de L-012 probe, werd L-012-afhankelijke chemiluminescentie afgeschaft door superoxide dismutase, wat aangeeft dat de voornaamste ROS gedetecteerd in deze reactie was superoxide anion 15. Latere studies hebben aangetoond dat L-012 kunnen andere vrije radicalen, inclusief reactieve stikstofverbindingen 16, 17 detecteren. Kielland et al. 17. Aangetoond dat topicale toediening van forbolmyristaatacetaat, een potente activator van NADPH oxidase, tot oxidase-afhankelijke ROS generatie die kon worden gedetecteerd in muizen met de luminescerende probe L-012 NADPH. In dit model toonden ze aan dat L-012-afhankelijke luminescentie werd afgeschaft phox p47 deficiënte muizen.
We vergeleken ROS productie in wildtype muizen en NADPH oxidase-deficiënte p47 phox / - muizen 2 in de volgende drie modellen: 1) intratracheale toediening van zymosan, een pro-inflammatoire schimmelcelwand afgeleid product dat NADPH oxidase kan activeren, 2) cecal ligatie en punctie (CLP), een model van intra-abdominale sepsis met secundaire acute longontsteking en de schade, en 3) orale tetrachloorkoolstof(CCl 4), een model van ROS-afhankelijke leverschade. Deze modellen zijn speciaal geselecteerd om NADPH oxidase-afhankelijke ROS productie evalueren in de context van niet-infectieuze ontsteking, sepsis polymicrobiële en toxine-geïnduceerde orgaanschade respectievelijk. Vergelijking bioluminescentie in wildtype muizen p47 phox / - muizen kunnen we bakenen de specifieke bijdrage van ROS gegenereerd door p47 phox bevattende NADPH oxidase de bioluminescent signaal in deze modellen.
Bioluminescentie resultaten die verhoogde niveaus ROS in wildtype muizen aangetoond vergeleken met p47 phox / - muizen aan dat NADPH oxidase is de belangrijkste bron van ROS productie in reactie op inflammatoire stimuli. Deze methode biedt een minimaal invasieve benadering voor "real-time" monitoring van ROS generatie tijdens ontsteking in vivo.
Protocol
1. Diermodellen
- Muizen: Gebruik p47 phox / - muizen en leeftijd en geslacht gematchte C57BL6/DBA muizen. Goedkeuring verkrijgen voor experimenten van Institutionele Animal Care en gebruik Comite.
- Anesthesie: Gebruik een continue isofluraan administratie systeem is om anesthesie te induceren. De verdamper-systeem (VetEquip) is gevuld met isofluraan (2-3%). Bevestig dat muizen volledig verdoofd door het observeren van de ademhaling, beweging en cornea reflex als reactie op externe prikkels.
- Chirurgische ingrepen: Schrob de chirurgische gebied (tafelmodel) met 70% ethanol. Draag steriele handschoenen en een schone chirurgische toga en masker. Bereid de muizen door het knippen van de haren en de toepassing betadine afgewisseld met 70% ethanol om het gebied waar de incisie wordt gemaakt. Voer een operatie op een steriel oppervlak en het gebruik van steriele instrumenten. Monitor muizen post-operatief tot wakker en vrij bewegen.
- Intratracheale zymosan administratie
- Dien anesthesiezoals beschreven in 1.2.
- Desinfecteer chirurgische gebied (nek) met betadine en 70% ethanol en bloot de luchtpijp door chirurgische dissectie.
- Pierce trachea met een 27-gauge naald en injecteer zymosan (St. Louis, MO) in een dosis van 1 ug / g met een 0,5 ug / ul oplossing (totaal volume 50 ui voor een 25 g muis) opgelost in steriele PBS.
- Sluiten muizen nek gewikkeld met 5-0 steriele zijden hechtdraden onder aseptische omstandigheden.
- Afbeelding na 4 uur en 24 uur.
- Cecal ligatie en punctie
- Dien anesthesie, zoals beschreven in 1.2.
- Clip haar in het operatiegebied (buik) en desinfecteren met betadine en 70% ethanol.
- Voer een middellijn laparotomie en identificeren van de blindedarm.
- Ligeren van het distale 50% van de blootgestelde blindedarm met 4-0 zijden hechtdraad en punctie blindedarm distaal van de ligatie met een passage van een 21-gauge naald.
- Sluit de incisie met 4-0 steriele zijde hechtingen.
- Afbeelding na 4 uur en24 hr.
- Orale tetrachloorkoolstof (CCl 4) administratie
- Dien anesthesie, zoals beschreven in 1.2.
- Dien CCl4 (2 ug / g, St. Louis, MO) opgelost in maïsolie met orale sondevoeding. De procedure van CCl4 toediening moet worden uitgevoerd in een aangewezen gebied in overeenstemming met de IBC / EHS-beleid.
- Afbeelding na 4 uur en 24 uur.
2. Het verwerven van een Bioluminescent Afbeelding
- Initialiseer de IVIS 200 (Xenogen Corporation, Alameda, Californië) Imaging System, ingesteld op luminescentie-modus, en wacht tot de charge-coupled device (CCD) temperatuur te vergrendelen.
- Selecteer belichtingstijd, binning (gemiddeld) en F / Stop (8) instellingen.
- Place muizen in rugligging in de beeldkamer op een verwarmde stadium normale lichaamstemperatuur. Dien anesthesie, zoals beschreven in 1.2 via neuskegel, terwijl muizen zijn in de IVIS beeldvorming kamer.
- Dien L-012 (20 ug / g) opgelost in steriel PBS (10 ug / ul) intraveneus via retro-orbitale injectie op elk tijdstip geselecteerd voor imaging.
- Fotograferen begint bij 2 min na injectie L-012. Wij gebruiken meestal een 40 sec belichting.
3. Data-analyse met behulp van Region of Interest
- Analyseer gegevens met behulp van Living Image software V.4.2 (Xenogen Corporation, Alameda, CA).
- Open een afbeelding en selecteer het meten van Region of Interest tools.
- Selecteer het gebied van belang vorm en grootte op de borst en / of buik na overlay een pseudo-gekleurde digitaal beeld (vertegenwoordiger van foton detectie) over een fotografisch beeld van de muis.
- Kwantificeren signaalintensiteit (foton flux) van het gebied van belang.
4. Statistische gegevens
- Gebruik statistische analyse software pakket om twee-weg ANOVA uit te voeren met Bonferroni post-test op sommige tijdstippen.
Zymosan is een pro-inflammatoire gistschillen product en een krachtige activator van NADPH oxidase 3. We toonden eerder aan dat intratracheale zymosan induceert een sterkere neutrofiele longontsteking en pro-inflammatoire cytokine productie p47 phox / - in vergelijking met wildtype muizen 1. Hier, ons doel was om ROS generatie vergelijken in de longen van wildtype en p47 phox / - muizen na zymosan uitdaging. Op 4 uur na zymosan intratracheale toediening we een aanzienlijke toename in fotonemissie op de borst in wildtype muizen vergeleken met de uitgangswaarde en een toename van fotonemissie in wildtype p47 vergeleken met phox / - muizen 4 uur en 24 uur. Daarentegen bioluminescentie signalen in p47 phox / - muizen bleven uitgangswaarden na 4 uur na zymosan behandeling (Fig.1 AB). Zo NADPH oxidase lijkt be de belangrijkste bron van ROS generatie in de longen na zymosan administratie.
Vervolgens hebben we onderzocht ROS productie in de CLP-geïnduceerde sepsis model. Sepsis is een levensbedreigende syndroom geassocieerd met eind-orgaan schade, met inbegrip van acute longbeschadiging (ALI) en acute respiratory distress syndrome (ARDS) 4, 5. ROS-gemedieerde schade is beschouwd als een belangrijke factor sepsis geïnduceerde meervoudig orgaanfalen zijn. We vonden dat ROS significant verhoogd op de borst (4 uur) en de buik (24 uur) na CLP in wildtype muizen vergeleken met de uitgangswaarde. Echter ROS levels in p47 phox / - muizen waren vergelijkbaar met de uitgangswaarden op beide tijdstippen (Fig.2 AC). Deze resultaten laten zien dat ROS productie in de CLP geïnduceerde sepsis muismodel NADPH oxidase-afhankelijk.
Ten slotte hebben we gebruikt bioluminescente beeldvorming de productie van ROS te detecteren in een CCl 4-geïnduceerde leverbeschadiging modusl. CCl4 veroorzaakt hepatocellulaire necrose, en is gebruikt om zowel acute leverbeschadiging en leverfibrose 6 model. In tegenstelling tot de eerder beschreven modellen voor ontsteking en schade, vonden we dat ROS productie in de buik bescheiden was (ongeveer 35%) ten opzichte van baseline in p47 phox / - muizen 4 uur na toediening CCl4. De omvang van CCl4 geïnduceerde ROS productie significant groter in wildtype muizen dan in p47 phox / - muizen (Fig.3 AB). Deze gegevens suggereren dat zowel p47 phox bevattende NADPH oxidase-afhankelijke en-onafhankelijke ROS productie optreden in acute CCl4 geïnduceerde leverbeschadiging.
Figuur 1. ROS productie in longen na zymosan behandeling. A) Vertegenwoordiger bioluminescence beeldvorming van ROS productie. Merk op dat naast de borst, luminescentie detecteerbaar over de buik in wildtype en p47-phox / - muizen en abdominale luminescentie onveranderd door zymosan behandeling. B) foton tellen vanaf de borst van wildtype en p47 phox / - muizen na een enkele intratracheale (IT) injectie van zymosan. Bioluminescentie beeldvorming werd uitgevoerd bij aanvang, 4 uur, en 24 uur. Lichtemissie van het gebied van belang op de borst werd geïdentificeerd met de aangegeven pseudo-kleurschaal. De resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± SE, n = 6 tot 9 per groep, * = p <0,05. Klik hier voor een grotere afbeelding .
Figuur 2. ROS detectie na CLP. A) Vertegenwoordiger bioluminescentie beeldvorming van ROS productie, B) Foton telt van de borst, en C) foton telt uit de buik van wildtype en p47 phox / - muizen bij aanvang, 4 uur, en 24 uur na de CLP. Resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± SE, n = 4-5 per groep, * = p <0,05. hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. ROS productie in de buik na CCl 4-geïnduceerde leverbeschadiging. A) Vertegenwoordiger bioluminescentie beeldvorming van ROS productie en B) foton tellen vanaf de buik van wildtype en p47 phox / - muizen bij aanvang, 4 uur, en 24 uur na de orale CCl 4 behandeling. Resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± SE;. N = 4-5 per groep, * = p <0,05 Klik hier voor een grotere afbeelding
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
"Real-time" meting van reactieve zuurstof species (ROS) in levende dieren kan worden bereikt door gebruik van fluorescerende en chemiluminescerende probes. Terwijl fluorescerende probes last hebben van zwak signaal-ruisverhoudingen 12, de beschreven beeldvormende techniek is gevoelig voor detectie van lichtemissie na een chemische reactie van ROS met luminol gebaseerde ondergrond L-012. Zoals alle bioluminescent beeldvormingstechnieken, is deze werkwijze beperkt door golflengte afhankelijke licht absorptie en verstrooiing van organen en weefsels. Deze experimenten werden gericht op het vaststellen juiste experimentele condities voor het meten van ROS in wildtype en p47-phox / - muizen. Het gebruik van deze genetisch gemodificeerde muizen kunnen we onderscheiden ROS gegenereerd door p47 phox bevattende NADPH oxidase van ROS gegenereerd door andere routes.
Hoewel functionele NADPH oxidase bevattende p47 is phOxeen belangrijke bron van ROS, andere NADPH oxidase isovormen bestaan, en extra ROS-genererende systemen, waaronder xanthine oxidase en mitochondriale ademhaling kan produceren ROS. NADPH-oxidase en andere ROS-genererende paden kan belangrijke en interactieve effecten van antimicrobiële afweer en downstream signaalwegen die ontstekingen en verwondingen zeven-tien moduleren. Met bioluminescentie, konden we de kinetiek van ROS productie in vivo meten en de bijdrage van NADPH oxidase om ROS levels in verschillende modellen inflammatoire bakenen.
Een beperking van deze methode betreft ruimtelijke resolutie van bioluminescentie. Hoewel we fluorescentie gemeten in specifieke anatomische compartimenten (bijvoorbeeld., Thorax, buik), is het moeilijk te lokaliseren de anatomische plaats van luminescentie bij orgaanniveau. In elk van onze experimentele modellen kozen we 3 keer punten voor bioluminescente metingen: baseline, 4 uur, en 24 uur. We weten niet of bioluminescente beeldvorming kunnen identificeren kleine verschillen in ROS generatie over kortere intervallen van analyse of de vraag of de relatie tussen de in vivo ROS generatie en bioluminescentie is lineair. Deze kwesties vereisen verdere studie. In de modellen voor deze onderzoeken vermoeden dat fagocytische cellen, neutrofielen en macrofagen aangetrokken, hoofdzakelijk verantwoordelijk voor ROS productie via de fagocyt NADPH oxidase systeem. Toekomstige studies waarin specifieke celtypen zijn uitgeput of bot hersenschimmen worden gegenereerd zou kunnen bieden extra kennis over de relatieve niveaus van ROS generatie van verschillende celpopulaties. Andere potentiële beperking van studies met L-012 is dat andere groepen (naast ROS) kunnen reageren met deze luminescerende probe, waardoor specificiteit voor detectie ROS in sommige omstandigheden.
Na sepsis, het ontbreken van ROS productie in p47 phox / - muizen blijkt dat NADPH oxidase isde belangrijkste bron van ROS in dit model van longontsteking. CLP is een van de meest voorkomende diermodellen van sepsis 11 en bioluminescentie geopenbaard verhoogde ROS signalen in zowel de long en buik die waren NADPH oxidase-afhankelijk. In tegenstelling tot de zymosan en CLP modellen werden verhoogd ROS in de buik van zowel wildtype en p47 phox / - muizen in vergelijking met de basislijn, maar in hogere mate in wildtype muizen, wat aangeeft dat CCI4 ROS productie induceert door p47 phOx - met NADPH-oxidase en andere mechanismen.
Samengevat onze gegevens dat een luminol gebaseerde bioluminescentie methode voor de detectie van ROS kan waardevol hulpmiddel voor onderzoek naar de regulering en gevolgen van ROS productie in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door NIH RO1 AI079253 en Department of Veterans Affairs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-012 | Wako Chemicals USA, Inc. | 120-04891 | |
| Zymosan | Sigma, St. Louis, MO | Z4250 | |
| carbon tetrachloride | Sigma, St. Louis, MO | 289116 |
References
- Segal, B., Han, W., Bushey, J. NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice. PLoS ONE. 5, e9631 (2010).
- Jackson, S., Gallin, J., Holland, S. M. The p47phox mouse knock-out model of chronic granulomatous disease. J. Exp. Med. 182, 751-758 (1995).
- Gantner, B. N., Simmons, R. M., Underhill, D. M. Collaborative induction of inflammatory responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2. J. Exp. Med. 197, 1107-1117 (2003).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends Microbiol. 19, 198-208 (2011).
- Tsiotou, A. G., Sakorafas, G. H., Bramis, J. Septic shock; current pathogenetic concepts from a clinical perspective. Med. Sci. Monit. 11, 76-85 (2005).
- Fujii, T., Fuchs, B. C., Tanabe, K. K. Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis: Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor. BMC Gastroenterology. 10, 79-90 (2010).
- Kubo, H., Morgensterm, D., Doerschuk, C. M. Preservation of complement-induced lung injury in mice with deficiency of NADPH oxidase. J. Clin. Invest. 97, 2680-2684 (1996).
- Segal, B., Sakamoto, N., Bulkley, G. B. Xanthine oxidase contributes to host defense against Burkholderia cepacia in the p47(phox-/-) mouse model of chronic granulomatous disease. Infect Immun. 68, 2374-2378 (2000).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological reviews. 82, 47-95 (2002).
- Jones, D. Radical-free biology of oxidative stress. American journal of physiology. Cell physiology. 295, C849-C868 (2008).
- Hubbard, W. J., Choudhry, M., Chaudry, I. H.
- Wardman, P. Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosative species in cells and tissues: progress, pitfalls, and prospects. Free Radic. Biol. Med. 43, 995-1022 (2007).
- Pollock, J. D., Williams, D. A., Gifford, M. A. Mouse model of X-linked chronic granulomatous disease, an inherited defect in phagocyte superoxide production. Nat. Genet. 9, 202-209 (1995).
- Aramaki, Y., Y,, Yoshida, H. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 554-559 (1993).
- Daiber, A., Oelze, M., August, M. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radic. Res. 38, 259-269 (2004).
- Kielland, A., Blom, T., Nandakumar, K. S. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).
