Het gebruik van primaire menselijke fibroblasten voor de monitoring van Mitochondriale fenotypes op het gebied van de ziekte van Parkinson
Summary
Fibroblasten van patiënten die mutaties in Parkinson's ziekte-veroorzakende genen vormen een gemakkelijk toegankelijke<em> Ex vivo</em> Model om de ziekte-geassocieerde fenotypes bestuderen. Live cell imaging biedt de mogelijkheid om morfologische en functionele parameters te bestuderen in levende cellen. Hier beschrijven we de bereiding van humane fibroblasten en opvolging van mitochondriale fenotypen.
Abstract
De ziekte van Parkinson (PD) is de tweede meest voorkomende bewegingsstoornis en komt voor bij 1% van de mensen boven de leeftijd van 60 1. Omdat de vergrijzing is de belangrijkste risicofactor, zullen gevallen van PD te verhogen tijdens de komende decennia 2. Naast pathologische vouwing van eiwitten en een verminderde afbraak van eiwitten paden, werden veranderingen van mitochondriale functie en morfologie gewezen als verdere kenmerk van neurodegeneratie bij PD 3-11.
Na jaren van onderzoek in muizen en menselijke kankercellen in vitro modellen voor moleculaire wegen van Parkinson ontleden, is het gebruik van humane fibroblasten van patiënten en geschikte controles ex vivo modellen een waardevol hulpmiddel voor onderzoek als mogelijke restricties worden beschouwd. Anders dan vereeuwigd, in plaats van kunstmatige cel modellen, primaire fibroblasten van patiënten die ziekte-geassocieerde mutaties blijkbaar weerspiegelen belangrijke pathologische kenmerken of de menselijke ziekte.
Hier hebben we af te bakenen van de procedure van het nemen van de huid biopten, kweken menselijke fibroblasten en met behulp van gedetailleerde protocollen voor essentiële microscopische technieken om mitochondriale fenotypes te definiëren. Deze werden gebruikt om verschillende functies die samenhangen met PD die relevant zijn voor mitochondriale functie en dynamiek onderzoeken. Ex vivo kan mitochondria worden geanalyseerd op hun functie, morfologie, colokalisatie met lysosomen (organellen de afbrekende disfunctionele mitochondria) en afbraak via de lysosomale pathway . Deze fenotypes zijn zeer relevant voor de identificatie van vroege tekenen van PD en kan voorafgaan aan de klinische motorische symptomen bij de mens de ziekte-gen dragers. Derhalve kan de hier gepresenteerde assays worden gebruikt als waardevolle tools pathologische kenmerken van neurodegeneratie te identificeren en nieuwe therapeutische strategieën definiëren PD helpen.
Protocol
Discussion
Huid van de patiënt fibroblasten als ex vivo modellen vormen een belangrijk instrument om de ziekte-geassocieerde genetische defecten te karakteriseren. Daarnaast, huid-afgeleide fibroblasten zijn gemakkelijk toegankelijk en kan worden uitgebreid op het kweken. Daarom primaire cellen verkregen van patiënten die PD-gerelateerde genetische mutaties de voorkeur boven het gebruik van tumor cellijnen zoals ze niet alleen de endogene otosclerosegen, maar de volledige genetische achtergrond van het aangetaste indivi…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Fritz Thyssen Foundation (10.11.2.153 te RK), de Duitse Raad voor Onderzoek (DFG, KR2119/3-2 en KR2119/8-1 te RK), het ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF , NGFNplus; 01GS08134 te RK) en door een doctoraatsbeurs van het charitatieve Hertie Foundation [naar LFB]. Wij danken Carolin Obermaier en Julia Westermeier voor hun steun tijdens de video shoot.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue no. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Invitrogen | 52400-025 |
| RPMI 1640 medium, no Phenol Red | Invitrogen | 11835-063 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Invitrogen | 14190-094 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 100-18B |
| AccuMax (detachment solution) | PAA | L11-008 |
| Lab-TekTMII chambered coverglasses | Nalge Nunc International | 115382 |
| Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE) | Invitrogen | T-669 |
| Mitotracker Green FM | Invitrogen | M-7514 |
| Mitotracker CM-H2XRos | Invitrogen | M-7513 |
| Lyostracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 |
Table 1. Specific reagents and equipment.
Referencias
- de Rijk, M. C., Launer, L. J., Berger, K., Breteler, M. M., Dartigues, J. F., Baldereschi, M., Fratiglioni, L., Lobo, A., Martinez-Lage, J., Trenkwalder, C. Prevalence of Parkinson’s disease in Europe: A collaborative study of population-based cohorts. Neurologic Diseases in the Elderly Research Group. Neurology. 54, 21-23 (2000).
- Dorsey, E. R., Constantinescu, R., Thompson, J. P., Biglan, K. M., Holloway, R. G., Kieburtz, K., Marshall, F. J., Ravina, B. M., Schifitto, G., Siderowf, A. Projected number of people with Parkinson disease in the most populous nations. Neurology. 68, 384-386 (2005).
- Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. Alpha-synuclein in Lewy bodies. Nature. 388, 839-840 (1997).
- Chung, K. K., Zhang, Y., Lim, K. L., Tanaka, Y., Huang, H., Gao, J., Ross, C. A., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Parkin ubiquitinates the alpha-synuclein-interacting protein, synphilin-1: implications for Lewy-body formation in Parkinson disease. Nature. 7, 1144-1150 (2001).
- Kruger, R., Eberhardt, O., Riess, O., Schulz, J. B. Parkinson’s disease: one biochemical pathway to fit all genes. Trends Mol. Med. 8, 236-240 (2002).
- Krebiehl, G., Ruckerbauer, S., Burbulla, L. F., Kieper, N., Maurer, B., Waak, J., Wolburg, H., Gizatullina, Z., Gellerich, F. N., Woitalla, D. Reduced basal autophagy and impaired mitochondrial dynamics due to loss of Parkinson’s disease-associated protein DJ-1. PLoS One. 5, e9367 (2010).
- Exner, N., Treske, B., Paquet, D., Holmstrom, K., Schiesling, C., Gispert, S., Carballo-Carbajal, I., Berg, D., Hoepken, H. H., Gasser, T. Loss-of-function of human PINK1 results in mitochondrial pathology and can be rescued by parkin. J. Neurosci. 27, 12413-12418 (2007).
- Burbulla, L. F., Krebiehl, G., Kruger, R. Balance is the challenge–the impact of mitochondrial dynamics in Parkinson’s disease. European journal of clinical investigation. 40, 1048-1060 (2010).
- Strauss, K. M., Martins, L. M., Plun-Favreau, H., Marx, F. P., Kautzmann, S., Berg, D., Gasser, T., Wszolek, Z., Muller, T., Bornemann, A. Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson’s disease. Human molecular genetics. 14, 2099-2111 (2005).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of cell biology. 183, 795-803 (2008).
- Dagda, R. K., Cherra, S. J., Kulich, S. M., Tandon, A., Park, D., Chu, C. T. Loss of PINK1 function promotes mitophagy through effects on oxidative stress and mitochondrial fission. The Journal of biological chemistry. , 284-13843 (2009).
- Kieper, N., Holmstrom, K. M., Ciceri, D., Fiesel, F. C., Wolburg, H., Ziviani, E., Whitworth, A. J., Martins, L. M., Kahle, P. J., Kruger, R. Modulation of mitochondrial function and morphology by interaction of Omi/HtrA2 with the mitochondrial fusion factor OPA1. Experimental cell research. 316, 1213-1224 (2010).
- Burbulla, L. F., Schelling, C., Kato, H., Rapaport, D., Woitalla, D., Schiesling, C., Schulte, C., Sharma, M., Illig, T., Bauer, P. Dissecting the role of the mitochondrial chaperone mortalin in Parkinson’s disease: functional impact of disease-related variants on mitochondrial homeostasis. Human molecular genetics. 19, 4437-4452 (2010).
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Nguyen, H. N., Byers, B., Cord, B., Shcheglovitov, A., Byrne, J., Gujar, P., Kee, K., Schule, B., Dolmetsch, R. E., Langston, W. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
- Seibler, P., Graziotto, J., Jeong, H., Simunovic, F., Klein, C., Krainc, D. Mitochondrial Parkin recruitment is impaired in neurons derived from mutant PINK1 induced pluripotent stem cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 5970-5976 (2011).
