A utilização de recursos primários fibroblastos humanos de Monitoramento Fenótipos mitocondriais no Campo da Doença de Parkinson
Summary
Fibroblastos de pacientes portadores de mutações no causadores de doenças de Parkinson genes representam um facilmente acessível<em> Ex vivo</em> Modelo para estudar doenças associadas fenótipos. Imagens de células vivas dá a oportunidade de estudar os parâmetros morfológicos e funcionais nas células vivas. Aqui, descrevemos a preparação de fibroblastos humanos e monitorização subsequente de fenótipos mitocondriais.
Abstract
A doença de Parkinson (DP) é o distúrbio de movimento segundo mais comum e afeta 1% das pessoas com idade superior a 60 1. Porque o envelhecimento é o fator de risco mais importante, os casos de PD irá aumentar durante as próximas décadas 2. Ao lado de dobramento de proteínas patológica e vias de degradação de proteínas com deficiência, alterações da função mitocondrial e morfologia foram apontados como característica adicional de neurodegeneração na DP 3-11.
Depois de anos de pesquisa em células de cancro de murídeo e humanos como em modelos in vitro, para dissecar vias moleculares do parkinsonismo, a utilização de fibroblastos humanos a partir de doentes e os controlos adequados como modelos ex vivo tornou-se uma ferramenta de investigação valiosa, se ressalvas potenciais são considerados. Outros que imortalizaram, modelos de células bastante artificial, fibroblastos primários de pacientes portadores de doença mutações associadas aparentemente refletem importantes características patológicas of a doença humana.
Aqui nós delinear o processo de realização das biópsias da pele, f ibroblastos humanos de cultura e meio de protocolos detalhados para técnicas microscópicas essenciais para definir fenótipos mitocondriais. Estas foram utilizadas para investigar as diferentes características associadas à DP que são relevantes para a função mitocondrial e dinâmica. Ex vivo, as mitocôndrias podem ser analisados em termos da sua função, morfologia, colocalização com lisossomas (os organelos degradante mitocôndrias disfuncionais) e através da via de degradação lisossómica . Estes fenótipos são muito relevantes para a identificação de sinais precoces de PD e pode preceder os sintomas motores da doença clínica em humanos do gene-transportadoras. Assim, os ensaios aqui apresentados podem ser utilizados como ferramentas valiosas para identificar as características patológicas da neurodegeneração e ajudar a definir novas estratégias terapêuticas na doença de Parkinson.
Protocol
Discussion
Fibroblastos da pele do paciente como modelos ex vivo representam uma ferramenta importante para caracterizar a doença associadas defeitos genéticos. Além disso, a pele derivados de fibroblastos são facilmente acessíveis e podem ser expandidos a cultura. Portanto, as células primárias obtidas a partir de pacientes portadores de PD-associadas mutações genéticas são preferíveis durante a utilização de linhas de células de tumor uma vez que contêm não só o gene causador de doença endógena, mas …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por doações do Fritz Thyssen Foundation (10.11.2.153 a RK), o alemão Conselho de Pesquisa (DFG, KR2119/3-2 e KR2119/8-1 a RK), o Ministério Federal da Educação e Pesquisa (BMBF , NGFNplus; 01GS08134 a RK) e por uma bolsa de doutoramento da Fundação de caridade Hertie [para LFB]. Agradecemos Carolin Obermaier e Julia Westermeier por seu apoio durante a filmagem do vídeo.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue no. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Invitrogen | 52400-025 |
| RPMI 1640 medium, no Phenol Red | Invitrogen | 11835-063 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Invitrogen | 14190-094 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 100-18B |
| AccuMax (detachment solution) | PAA | L11-008 |
| Lab-TekTMII chambered coverglasses | Nalge Nunc International | 115382 |
| Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE) | Invitrogen | T-669 |
| Mitotracker Green FM | Invitrogen | M-7514 |
| Mitotracker CM-H2XRos | Invitrogen | M-7513 |
| Lyostracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 |
Table 1. Specific reagents and equipment.
Referencias
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