Un método para procesar humano material de descarte mamaria quirúrgica se describe. Tejido procesado, en forma de organoides, se pueden almacenar indefinidamente congelados o ponen en cultivo para crecimiento a largo plazo. Este método permite el examen experimental de la normalidad biología celular epitelial humana, y los efectos de las perturbaciones exógenas.
Experimental examen de lo normal de células epiteliales mamarias humanas (HMEC) el comportamiento, y cómo las células normales adquieren propiedades anormales, puede ser facilitado por es sistemas de cultivo in vitro que más exactamente modelo es biología vivo. El uso de material humano obtenidos para el estudio de la diferenciación celular, el envejecimiento, la senescencia y la inmortalización es particularmente ventajosa teniendo en cuenta las muchas diferencias significativas en estas propiedades moleculares entre las células de roedores y humanos utilizados comúnmente 1-2. Células mamarias presentan un sistema de modelo conveniente porque grandes cantidades de tejidos normales y anormales se encuentran disponibles debido a la frecuencia de mamoplastia de reducción y cirugías de mastectomía.
La glándula mamaria se compone de una mezcla compleja de muchos tipos de células diferentes, por ejemplo, adiposo epiteliales, endoteliales, mesenquimal,. Las células epiteliales son responsables de la función diferenciada mamaria de la lactancia,y también son el origen de la gran mayoría de los cánceres de mama humanos. Hemos desarrollado métodos para procesar tejidos de la glándula mamaria quirúrgicos de descarte en puras componentes epiteliales así como las células mesenquimales 3. El material procesado puede almacenar congelada indefinidamente, o iniciados en cultivo primario. Material de descarte quirúrgico se transporta al laboratorio y se disecaron manualmente para enriquecer en tejido epitelial que contiene. Digestión subsiguiente del tejido diseccionado utilizando colagenasa y hialuronidasa material de tiras de estroma de los epitelios en la membrana basal. Las piezas resultantes pequeñas del árbol epitelial (organoides) se puede separar de la estroma digerido por filtración secuencial en las membranas de tamaño de poro fijo. Dependiendo del tamaño de poro, las fracciones se puede conseguir que consiste de grandes ductales / alveolar, piezas pequeñas agrupaciones alveolares, o células estromales. Hemos observado un crecimiento superior cuando las culturas se inician como organoides y no como disasociada células individuales. La colocación de organoides en la cultura, baja fatiga medios inductores de apoyo a largo plazo el crecimiento de HMEC normal con marcadores de linaje tipos múltiples (mioepiteliales, progenitor luminal) 4-5. Un número suficiente de células pueden ser obtenidas a partir de tejido de un individuo para permitir el examen extenso experimental utilizando lotes estandarizados de células, así como de interrogación utilizando las modalidades de alto rendimiento.
HMEC Cultured se han empleado en una amplia variedad de estudios que examinan los procesos normales que regulan el crecimiento, la diferenciación, el envejecimiento y la senescencia, y cómo estos procesos normales se alteran durante la transformación maligna inmortal y 4-15,16. Los efectos de crecimiento en la presencia de material de matriz extracelular, otros tipos de células, y / o cultivo 3D puede ser comparado con el crecimiento en el plástico 5,15. HMEC Cultivadas, comenzando con las células normales, proporcionar un sistema experimentalmente tratable para examinar los factores que lospuede impulsar o impedir el envejecimiento humano y la carcinogénesis.
La humana método de procesado de tejido mamario que aquí se presenta permite la obtención de células epiteliales mamarias puros de la mezcla heterogénea de tipos de células en el pecho humano. La filtración a través de poros de tamaño fijo permite la separación de las diferentes fracciones de la glándula mamaria (por ejemplo, ductal y alveolar ductal-vs alveolar) de la matriz estromal digerido. Isogénicas fibroblastos mamarias se puede obtener para que coincida con las células epiteliales. El material congelado digerido ha conservado buena viabilidad durante más de 30 años. Este método ha funcionado con éxito en todos los tejidos mamarios pero muy fibrosas, y es simple de realizar. Otras variaciones de procesamiento de tejido mamario que existen no proporcionan fracciones epiteliales que son tan viables, limpio, o separados. La colocación de organoides procesados en cultivo con bajos estresantes medios como M87A permite crecimiento a largo plazo de HMEC con marcadores de linaje múltiple. HMEC que han sido cultivadas en plástico todavía conservan la capacidad de génerosdel te 3D estructuras con normalidad en las relaciones de linaje vivo-como. Estos cultivos HMEC son adecuados para una amplia investigación experimental, incluyendo un alto rendimiento, de comportamiento normal HMEC y factores que pueden impulsar o inhibir senescencia y transformación.
The authors have nothing to disclose.
MAL, JCG, y MRS son apoyados por el NIA (R00AG033176 y R01AG040081) y por el Laboratorio de Investigación y Desarrollo Dirigido, EE.UU. Departamento de Energía # contrato DE-AC02-05CH11231.
Glass Petri dish 15 cm | VWR | 89000-308 |
Scissors 6.5″ | VWR | 82027-594 |
Forceps 8″ | VWR | 82027-436 |
Scalpels disposable | Miltex | 4-411 |
Collagenase | SIGMA | C0130 |
Hyaluronidase | SIGMA | H3506 |
Insulin | SIGMA | I5500 |
DMSO | SIGMA | D8418 |
Pennicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 |
Fungizone | Life Technologies | 15290-018 |
Polymixin B sulfate | Life Technologies | 21850-029 |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-087 |
Trypsin 0.05% 100 ml | Life Technologies | 25300-054 |
DMEM/F12 | Life Technologies | 11039-021 |
HulaMixer | Life Technologies | 159-20D |
Cell strainer 100 μm | BD Falcon | 352360 |
Cell strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 |
Tubes 15 ml | Greiner bio-one | 188-261 |
Tubes 50 ml | Greiner bio-one | 227-261 |
TC dishes 10 cm | Greiner bio-one | 664-160 |
TC dishes 6 cm | Greiner bio-one | 628-160 |
Cryogenic vials | Nalgene | 5000-1020 |
Heamocytometer | Hauser Scientific | 1490 |
Centrifuge | Eppendorf model | 5702 |