在微RNA在腹鸡中脑大毛表达

Summary

异位表达的是一种技术来阐明大脑发育的小分子RNA的作用。但是，使用在OVO电针对特定领域是具有挑战性的。这里，我们表明一个有效的方式来选择性电穿孔腹侧和背侧中脑区域。

Abstract

非编码RNA是另外玩家在调节基因表达。针对在特定领域OVO电提供了空间和时间的控制异位microRNA表达谱的独特工具。不过，腹脑结构，如中脑腹侧是相当难以达成任何操作。在这里，我们展示了使用薄的铂电极电穿孔的miRNA进入中脑腹侧一种有效的方式。这种方法提供了一种可靠的方法转染中脑和体内研究的有用工具的特定区域。

Introduction

小非编码RNA作为额外的球员基因表达的识别推出了新的复杂的基因组编程/基因调控。不同品种的非编码RNA在神经细胞，包括非编码小分子RNA ^1-4功能的重要性。小分子RNA（MIR或miRNA）为例说明在开发大脑^5个不同的和不断变化的表达谱。有针对性的鸡胚蛋内电穿孔提供了开发过程中的基因表达和沉默的时间和空间控制一个独特的机会。

本视频演示了不同的步骤，使用在OVO电^6-10在鸡脑的特定区域进行miR的异位表达。为了确保在这些细胞中的小非编码RNA的效果持久，miR的DNA序列克隆到单或双顺反子载体。 在OVO电中，miR含v厄克托基是通过使一个小窗口，在蛋壳后露出的胚胎注入到中脑的神经管。转染的脑小加（阳极）和减号（阴极）的特定区域的铂电极被放置在特定的位置上。对于腹侧中脑的转染，所述阳极被置于左侧中脑腹侧和上面的中脑的右半边的阴极施加电流前下方。在蛋壳的开口被封闭，磁带和胚胎孵育只要所需的任何分析。该方法最初是由村松等 ⁶所描述和特定区域的转染改善了由百濑等 ^8。

原理概述。

1. 在鸡蛋胚胎是通过切割一个小窗口，进入次曝光Ë蛋壳。
2. 溶解的载体（s）是注入到使用微毛细管中脑。
3. 两个电极 – 平行放置，或根据与上面的胚胎 – 产生一个脉冲电场。
4. 电场在时间上产生毛孔中的细胞膜，从而促进进入细胞由带负电荷的DNA（或RNA）被吸引到阳极^11,12。

Protocol

1。用于在OVO电要求 制备的载体构建：的miR义和反义引物设计后Ambion公司的指示，退火并连接到的ApaI / EcoRI位消化的pSilencer U6.1载体。成功转型后所产生的克隆人被种植和使用Quiagen公司的midi制备试剂盒的pSilencer质粒分离碱裂解法。 电极：电极可以购买或容易建立13。我们使用铂丝的自制电极（Φ= 0.2，0.25或0.5毫米的直径），或者在某些情况?…

Representative Results

转染了miR中脑区域的范围是可见的，通过GFP的从沿与所述miR表达载体（ 图2）喷射的报告基因载体的表达。使用铂电极的直径为0.5mm且平行放置脑引线的AP轴通常为大面积的转染沿DV-和AP-轴，包括后脑，中脑和间脑有时（ 图2A和B）。的电极的结果在宽的电场的大小施加到大脑区域，因此广泛染区。 它难以精确地定位，比如例如在腹侧中脑区域。降低0.5…

Discussion

该视频演示了转染质粒转化的小鸡脑的特定区域的神经上皮细胞的有效方法。低电压的矩形电脉冲可以将DNA引入小鸡神经管细胞大毛 ^6,16。但是，DNA的定位精度由宽电场，其上升通过比较大的电极（Φ= 0.5mm）的经常受阻。我们试图通过下面的百濑等 ⁸的指引，使用电极直径小，以解决这个问题。对于腹侧中脑转染，我们将阴极区带蛋白或膜下如果胚胎的年龄允许它正?…

Materials

Name	Company		Model
Borosillicate glass capillaries	Hartenstein		Model: 0.9 mm
Microcapillary puller	WPI, Berlin		Model: Pul1-E
Electroporator	Intracel		Model: TSSIC
Stereomicroscope – fluorescence	LEICA		Model: MZFLIII
Stereomicroscope	Zeiss		Model: Stemi
Camera and software	Zeiss		Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8