Em Expression in ovo de microRNA em Ventral Pintinho Midbrain

Summary

A expressão ectópica é uma técnica para elucidar o papel microRNAs no desenvolvimento do cérebro. No entanto, em áreas específicas usando a eletroporação in ovo é um desafio. Aqui, vamos mostrar uma maneira eficiente para regiões do mesencéfalo ventral e dorsal seletiva electroporate.

Abstract

RNAs não-codificantes são jogadores adicionais na regulação da expressão gênica. Alvejado em eletroporação in ovo de áreas específicas fornece uma ferramenta única para o controle espacial e temporal da expressão do microRNA ectópica. No entanto, as estruturas cerebrais ventral como mesencéfalo ventral são bastante difíceis de alcançar por quaisquer manipulações. Aqui, nós demonstramos uma forma eficiente de electroporate miRNA em mesencéfalo ventral utilizando eletrodos de platina finas. Este método oferece uma maneira confiável de transfecção de áreas específicas do cérebro médio e uma ferramenta útil para estudos in vivo.

Introduction

O reconhecimento de pequenos RNAs não-codificantes como jogadores adicionais para a expressão do gene de lançar uma nova complexidade à regulamentação de programação / gene do genoma. Diferentes espécies de RNAs não-codificantes tem importância funcional em células neurais, incluindo pequeno RNAs não-codificantes ^1-4. MicroRNAs (MIR ou miRNA), por exemplo, mostram perfis de expressão distintas e mutáveis ​​em cérebros em desenvolvimento ^5. Alvejado em eletroporação in ovo de embriões de galinha oferece uma oportunidade única para o controle temporal e espacial da expressão gênica e silenciamento durante o desenvolvimento.

Este vídeo demonstra as diferentes etapas da realização de expressão ectópica da RIM em áreas específicas do mesencéfalo garota usando eletroporação in ovo ^6-10. Para assegurar um efeito de longa duração destes pequenos RNAs não-codificantes nas células, a sequência de ADN de RIM, foram clonados em vectores de mono-ou bi-cistronic. Pois em eletroporação in ovo, miR contendo vector é injectado no tubo neural mesencéfalo expondo o embrião depois de fazer uma pequena janela na casca do ovo. Para transfectar as áreas específicas do cérebro médio mais pequeno (ânodo) e negativo (cátodo) eléctrodos de platina são colocados em posições específicas. Para a transfecção do mesencéfalo ventral, o ânodo é colocado por baixo do mesencéfalo ventral esquerdo e o cátodo acima da metade direita do cérebro médio, antes de aplicar uma corrente. A abertura na casca do ovo é fechado com fita adesiva e os embriões foram incubados durante o tempo necessário para qualquer análise. Este método foi originalmente descrito por Muramatsu et al. ⁶ e melhorado por Momose et al. ⁸ para transfecção área específica.

Visão esquemática.

1. O embrião no ovo é exposta pelo corte de uma pequena janela em the casca de ovo.
2. O vector dissolvido (s) é injectado no mesencéfalo usando um tubo capilar de micro.
3. Dois eletrodos colocados – paralelo ou por baixo e por cima do embrião – gerar um campo elétrico pulsado.
4. O campo eléctrico temporalmente cria poros na membrana da célula, que facilitam a entrada na célula de ADN carregadas negativamente (ou RNA) atraídos para o ânodo ^11,12.

Protocol

1. Requisitos para in ovo Eletroporação Preparação da construção de vector: miR sentido e anti-sentido foram concebidos iniciadores após as instruções de Ambion, recozidos e ligados em Apal / EcoRI digerido pSilencer U6.1 vector. Após a transformação bem sucedida de um dos clones resultantes foram cultivadas e pSilencer plasmídeo foi isolado pelo método de lise alcalina, utilizando um kit de preparação Qiagen Midi. Eletrodos: Eletrodos podem…

Representative Results

A extensão da área mesencéfalo transfectadas com miR é visível através da expressão de GFP a partir de um vector repórter injectado, juntamente com o vector de expressão de miR (Figura 2). Usando eléctrodos de platina com um diâmetro de 0,5 mm e colocado paralelamente ao eixo de AP de ligações mesencéfalo normalmente para a transfecção de uma área ampla e ao longo do eixo-DV AP, incluindo a parte posterior do cérebro, e por vezes mesencéfalo diencéfalo (Figuras 2A e B).</stro…

Discussion

Este vídeo demonstra um método eficaz para transfectar plasmídeo nas células neuroepiteliais de áreas específicas do cérebro médio do pintainho. Pulsos elétricos retangulares de baixa tensão pode introduzir DNA em células do tubo neural garota em ovo ^6,16. No entanto, a precisão da segmentação DNA é muitas vezes dificultada pela grande campo elétrico, que sobe através das relativamente grandes eletrodos (Φ = 0,5 mm). Nós tentamos resolver esse problema usando eletrodos menores em d…

Materials

Name	Company		Model
Borosillicate glass capillaries	Hartenstein		Model: 0.9 mm
Microcapillary puller	WPI, Berlin		Model: Pul1-E
Electroporator	Intracel		Model: TSSIC
Stereomicroscope – fluorescence	LEICA		Model: MZFLIII
Stereomicroscope	Zeiss		Model: Stemi
Camera and software	Zeiss		Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8