En Expression in ovo de microARN en ventral del polluelo Midbrain

Summary

La expresión ectópica es una técnica para dilucidar el papel microRNAs en el desarrollo del cerebro. Sin embargo, la focalización es áreas específicas mediante electroporación in ovo es un reto. Aquí, se muestra una forma eficiente a las regiones del cerebro medio ventral y dorsal selectiva electroporar.

Abstract

RNAs no codificantes son jugadores adicionales en la regulación de la expresión génica. Dirigida es la electroporación in ovo de áreas específicas proporciona una herramienta única para el control espacial y temporal de la expresión de microARN ectópico. Sin embargo, las estructuras del cerebro como ventrales del cerebro medio ventral son más bien difíciles de alcanzar para cualquier manipulaciones. Este sentido, demuestran una forma eficiente de electroporar miRNA en el mesencéfalo ventral usando electrodos de platino delgada. Este método ofrece una forma fiable para transfectar las áreas específicas del cerebro medio y una herramienta útil para los estudios in vivo.

Introduction

El reconocimiento de los ARN no codificantes pequeños como reproductores adicionales para la expresión de genes lanzó una nueva complejidad a la regulación genómica de programación / gen. Las diferentes especies de RNAs no codificantes tienen importancia funcional en las células neuronales, incluidos los pequeños no codificante RNAs ^1-4. Los microARN (miR o miARN), por ejemplo, muestran distintos perfiles de expresión y los cambios en los cerebros en desarrollo ^5. Dirigida es la electroporación in ovo de embriones de pollo ofrece una oportunidad única para el control temporal y espacial de la expresión génica y el silenciamiento durante el desarrollo.

Este video muestra las diferentes etapas de realizar la expresión ectópica de MIR en áreas específicas del cerebro medio pollito utilizando electroporación in ovo ^6-10. Para garantizar un efecto de larga duración de estos pequeños RNAs no codificantes en las células, la secuencia de ADN del MIR fueron clonados en vectores de mono o bi-cistrónicos. Porque es la electroporación in ovo, MIR contiene vEctor se inyecta en el tubo neural del cerebro medio exponiendo el embrión después de hacer una pequeña ventana en la cáscara del huevo. Para transfectar áreas específicas del cerebro medio, más pequeño (ánodo) y negativo (cátodo) electrodos de platino se colocan en posiciones específicas. Para la transfección cerebro medio ventral, el ánodo se coloca debajo de la mesencéfalo ventral izquierda y el cátodo encima de la mitad derecha del cerebro medio antes de la aplicación de una corriente. La abertura en la cáscara del huevo se cierra con cinta y los embriones se incuban durante todo el tiempo necesario para cualquier análisis. Este método fue descrito originalmente por Muramatsu et al. ⁶ y mejorado por Momose et al. ⁸ para la transfección área específica.

Resumen Esquemático.

1. El embrión en el huevo es expuesto por el corte de una pequeña ventana en the cáscara de huevo.
2. El vector (s) disuelta se inyecta en el cerebro medio usando un capilar micro.
3. Dos electrodos – colocados en paralelo o por debajo y por encima del embrión – generan un campo eléctrico pulsante.
4. El campo eléctrico crea temporalmente poros en la membrana celular, que facilitan la entrada en la célula por el ADN cargado negativamente (o ARN) atraído hacia el ánodo ^11,12.

Protocol

1. Requisitos para la electroporación in ovo Preparación de la construcción del vector: sentido y antisentido mir primers fueron diseñados después de las instrucciones de Ambion, recocidas y se ligaron en ApaI / EcoRI digerido pSilencer pSilencer U6.1 vector. Después de la transformación con éxito uno de los clones resultantes se cultivó y el plásmido pSilencer pSilencer se aisló por el método de lisis alcalina utilizando un kit de preparación de MIDI Quiagen. …

Representative Results

La extensión de la zona del cerebro medio transfectadas con MIR es visible a través de la expresión de GFP a partir de un vector indicador inyectado junto con el vector de expresión de miR (Figura 2). El uso de electrodos de platino con un diámetro de 0,5 mm y colocado paralelo al eje de AP de cables del cerebro medio normalmente a la transfección de una zona amplia a lo largo de la-y DV AP-eje, incluyendo rombencéfalo, mesencéfalo y diencéfalo veces (Figuras 2A y B). El tamañ…

Discussion

Este video muestra un método eficaz para transfectar plásmido en las células neuroepiteliales de áreas específicas del cerebro medio pollito. Pulsos eléctricos rectangulares de baja tensión pueden introducir ADN en las células del tubo neural de pollo in ovo ^6,16. Sin embargo, la exactitud de la focalización de ADN a menudo se ve obstaculizada por el campo eléctrico de ancho, que se eleva a través de los electrodos relativamente grandes (Φ = 0,5 mm). Hemos tratado de hacer frente a ese pr…

Materials

Name	Company		Model
Borosillicate glass capillaries	Hartenstein		Model: 0.9 mm
Microcapillary puller	WPI, Berlin		Model: Pul1-E
Electroporator	Intracel		Model: TSSIC
Stereomicroscope – fluorescence	LEICA		Model: MZFLIII
Stereomicroscope	Zeiss		Model: Stemi
Camera and software	Zeiss		Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8