Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen

Summary

We beschrijven een single-cell high-throughput assay voor cytotoxiciteit van T-cellen te meten wanneer geïncubeerd met tumor doelcellen. Deze werkwijze gebruikt een dichte, elastomeer reeks sub-nanoliter wells (~ 100.000 putjes / array) ruimtelijk beperken de T-cellen en doelcellen met gedefinieerde verhoudingen en is gekoppeld met fluorescentie microscopie effector-target conjugatie en daaropvolgende apoptose controleren.

Abstract

Immunotherapie van kanker kunnen benutten van de specificiteit van immuunrespons op te richten en te elimineren tumoren. Adoptieve celtherapie (ACT) gebaseerd op de adoptieve overdracht van T-cellen genetisch gemodificeerd om een chimeer antigen receptor (CAR) expressie blijkt aanzienlijke belofte in klinische proeven ^1-4. Er zijn verscheidene voordelen aan het gebruik CAR ⁺ T cellen voor de behandeling van kanker inclusief de mogelijkheid om niet-MHC beperkte antigenen te richten en de T-cellen voor optimale overleving, homing en persistentie in de gastheer functionaliseren en uiteindelijk apoptose induceren van CAR ⁺ T-cellen bij ontvangst toxiciteit ^5.

Afbakening van de optimale functies van CAR ⁺ T cellen geassocieerd met klinische voordelen zijn essentieel voor het ontwerpen van de volgende generatie klinische trials. Recente ontwikkelingen in levende dieren imaging zoals multifoton microscopie hebben een revolutie in de studie van de immuun cel functie in ^6,7 vivo. Hoewel deze studies hebben ons begrip van T-cel functie in vivo, T-cel-gebaseerde ACT in klinische proeven vereist de noodzaak moleculaire en functionele kenmerken van T-cel preparaten koppelen pre-infusie met klinische werkzaamheid na de injectie door gebruik in vitro testen bewaken T-cel functies zoals, cytotoxiciteit en cytokine secretie. Flow-cytometrie standaard gebaseerde testen ontwikkeld die bepalen de algemene werking van populaties van T-cellen in de eencellige niveau, maar deze zijn niet geschikt voor het bewaken conjugaat vorming en levens of het vermogen van dezelfde cel te doden meerdere doelen ^8.

Microfabricated arrays ontworpen biocompatibele polymeren zoals polydimethylsiloxaan (PDMS) een bijzonder aantrekkelijke methode om ruimtelijk beperken effectoren en targets in kleine volumes ^9. In combinatie met automatische time-lapse fluorescentiemicroscopie, thousands van effector-target interacties gelijktijdig monitoren door beeldvorming afzonderlijke putjes van een nanowell array. We stellen hier een high-throughput methode daartoe T-cel gemedieerde cytotoxiciteit bij de eencellige niveau breed toepasbaar voor onderzoek naar de functies van cytolytische T-cellen.

Protocol

1. Reagentia Voorbereiding Bereid RPMI-PLGH door mengen 500 ml RPMI-1640 en 5 ml elk van penicilline-streptomycine, L-glutamine en HEPES oplossing. Bereid R10 oplossing mengen RPMI-PLGH met 10% foetaal runderserum (FBS). De FBS is hitte-geïnactiveerd bij 56 ° C gedurende 30 minuten voorafgaand aan toevoeging. Voorverwarmen bij 37 ° C 50 ml van RPMI-PLGH, 15 ml PBS en 15 ml R10 in steriele conische buizen. Fabricage van arrays van nanowells in PDMS: De silicium master vervaardi…

Representative Results

Een voorbeeld van de toepassing van de high-throughput cytolytische assay aangetoond in figuur 2. Kort, gemerkt CD19-specifieke CAR + T-cellen werden geco-incubeerd met gelabelde muizen EL4 doelcellen in de afzonderlijke putjes van een nanowell array (hoofdstukken 1-5). Een eerste beeld werd opgenomen op de geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop om de bezettingsgraad (effectoren en / of doelstellingen) van elke nanowell te identificeren op de array (hoofdstuk 6). Beeldverwerking werd gebrui…

Discussion

We hebben geschetste protocol voor een high-throughput eencellige cytolytische assay geactiveerd door co-incubatie van effectors en doelen in arrays van nanowells (figuur 1). Naast throughput een belangrijk voordeel van de techniek is de mogelijkheid om effector-gemedieerde cytotoxiciteit tegen gewenste doelcellen volgen zonder doelcel techniek wat op zijn beurt het gebruik van autologe of matched / primaire tumorcellen als doelcellen. De ruimtelijke opsluiting maakt het ophalen en daaropvolgende kloner…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
RPMI-1640 w/o L-glutamine	Cellgro	15-040-CV
Penicillin-streptomycin	Cellgro	30-002-CI	10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin
L-glutamine	Cellgro	25-005-CI	200 mM solution
HEPES	Sigma Aldrich	H3537	1M
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150	Lot tested
Cell Tracker Red Stain	Invitrogen	C34552	50 μg
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Invitrogen	V35003	5 mM
SYTOX green Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S7020	5 mM
Annexin V-Alexa Fluor 647	Invitrogen	A23204	500 μl
Dulbecco’s PBS	Cellgro	21-031-CV	500 ml
Noble agar	DIFCO	2M220	100 g
Trypan Blue	Sigma Aldrich	T8154	0.4% liquid, sterile filtered
Hemocytometer	Hausser Scientifics	1492	Bright line
4-well plate	Thermo Fisher	167603
Harrick Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Basic plasma cleaner
Observer.Z1	ZEISS		Fluorescent microscope (works with the three parts below)
Lambda 10-3	Sutter Instrument		Filter controller
Lambda DG-4	Sutter Instrument		Ultra-High-Speed Wavelength switcher
Hamamatsu EM-CCD Camera	Hamamatsu	C9100-13	CCD-Microscope camera
15 ml conical tube	BD Falcon	352097
50 ml conical tube	VWR	3282-345-300
Nikon Biostation	Nikon Instruments Inc.	Biostation IM
Glass bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-0	35 mm petri dish, 10 mm microwell