T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석
Summary
우리는 종양 대상 세포와 incubated 때 T 세포의 세포 독성을 측정 할 수있는 단일 셀 높은 처리량 분석을 설명합니다. 이 방법은 spatially 정의 비율에서 T 세포와 대상 세포를 한정하는 하위 nanoliter 우물 (~ 100,000 우물 / 배열)의 조밀 한, 탄성 배열을 사용하고 이펙터 – 대상 활용 및 후속 apoptosis를 모니터링하는 형광 현미경에 연결된다.
Abstract
암 immunotherapy는 종양을 타겟팅하고 제거하는 면역 반응의 특이성을 활용 할 수 있습니다. 유전자 키메라 항원 수용체 (자동차)을 표현하도록 수정 T 세포의 입양 전송을 기반으로 입양 세포 치료 (ACT)는 임상 실험 1-4에서 상당한 약속을 보여 주었다. 이 자동차를 사용하여 + T 세포 비 MHC 제한 항원을 타겟팅하고 호스트에서 추적 및 지속성 최적의 생존을위한 T 세포를 functionalize 할 수있는 능력을 포함 암의 치료를 위해 다음과 같은 여러 장점이 있습니다, 그리고 마지막으로 자동차의 apoptosis를 유도하기 + 호스트 독성 (5)의 경우에 T 세포.
자동차의 최적의 기능을 Delineating + 임상 이익과 관련된 T 세포가 임상 시험의 다음 세대를 디자인하는 것이 필수적입니다. multiphoton 현미경 같은 라이브 동물 이미징의 최근 발전 면역 세포 기능의 연구를 혁신 한 전N 생체 6,7. 이 연구 생체, 임상 실험에서 T-세포 기반 ACT에서 T-세포 기능의 우리의 이해를 전진했지만에 활용하여, 사전에 주입 임상 효능 후 주입와 T-세포 준비의 분자 및 기능 기능을 연결 할 필요가 필요합니다 세포 독성 및 시토 킨 분비, 같은 T-세포 기능을 모니터링 체외 assays. 표준 흐름 세포 계측법 기반 assays은 단일 셀 수준의 T 세포 인구의 전반적인 기능을 결정하지만, 이러한 공액 형성과 수명 또는 여러 대상에게 8 죽일 같은 세포의 기능을 모니터링에 적합하지 않다고 개발되었습니다.
polydimethylsiloxane (PDMS) 등의 biocompatible 폴리머로 설계 Microfabricated 배열 spatially effectors 작은 볼륨 9 대상을 한정 할 수있는 특히 매력적인 방법입니다. 자동 시간 경과 형광 현미경, tho와 함께효과기 – 대상의 상호 작용 usands은 nanowell 배열의 이미징 개인 우물에서 동시에 모니터링 할 수 있습니다. 우리는 여기서 크게 T 세포의 cytolytic 기능을 공부에 적용 할 수있는 단일 셀 레벨에서 T-세포 매개의 세포 독성을 모니터링하기위한 높은 처리량 방법론을 제시한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 nanowells의 배열 (그림 1) effectors 및 대상의 공동 배양을 통해 활성화 높은 처리량 단일 셀 cytolytic 분석을위한 프로토콜을 설명하고 있습니다. 처리량뿐만 아니라 기술의 주요 장점은 결과적으로 대상 셀과 autologous 또는 기본 / 검색 종양 세포의 사용을 허용 대상 세포 공학 필요없이 원하는 대상 세포에 대한 이펙터로 인한 세포 독성을 모니터링 할 수있는 기능입니다. 공간 제?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
연구 상 번호 R01CA174385에 따라 국립 보건원 국립 암 연구소에 의해 지원 된이 출판물에보고했다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 전망을 대표하지 않습니다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| RPMI-1640 w/o L-glutamine | Cellgro | 15-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200 mM solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3537 | 1M |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Lot tested |
| Cell Tracker Red Stain | Invitrogen | C34552 | 50 μg |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Invitrogen | V35003 | 5 mM |
| SYTOX green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | 5 mM |
| Annexin V-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A23204 | 500 μl |
| Dulbecco’s PBS | Cellgro | 21-031-CV | 500 ml |
| Noble agar | DIFCO | 2M220 | 100 g |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | 0.4% liquid, sterile filtered |
| Hemocytometer | Hausser Scientifics | 1492 | Bright line |
| 4-well plate | Thermo Fisher | 167603 | |
| Harrick Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Basic plasma cleaner |
| Observer.Z1 | ZEISS | Fluorescent microscope (works with the three parts below) | |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | Filter controller | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instrument | Ultra-High-Speed Wavelength switcher | |
| Hamamatsu EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-13 | CCD-Microscope camera |
| 15 ml conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tube | VWR | 3282-345-300 | |
| Nikon Biostation | Nikon Instruments Inc. | Biostation IM | |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0 | 35 mm petri dish, 10 mm microwell |
Referencias
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