바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의
Summary
우리는 기본 T 세포를 사용하여 염색질의 immunoprecipitation위한 강력한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 방법에 설립 있지만, 세포의 제한된 수량에 대한 효율성을 개선 조건과 시약의 특정 집합을 사용합니다. 중요한 데이터 분석 단계에 대한 자세한 설명이 표시됩니다.
Abstract
염색질의 immunoprecipitation (칩)은 살아있는 세포의 염색질의 DNA와 다른 단백질의 상호 작용을 결정하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 예를 들면 시퀀스 특정 DNA 결합 전사 인자, 히스톤과 다른 수정 상태와 같은 RNA 중합 효소와 보조 인자와 같은 효소와 DNA 복구 구성 요소를 포함. 그 편재에도 불구하고, 소재 모두 벤치 준비 및 상호 작용의 정량적 측정을 허용 정확한 분석을위한 최신 상세한 방법론의 부족이있다. 정보의 부족으로 인해, 또한 어떤 면역 침전과 같은 조건이 실험 조건의 새로운 집합에 대해 다시 최적화해야하기 때문에 칩의 분석은 부정확하거나 잘못 정량 결과에 감염 될 수 있습니다.
우리의 프로토콜은 궁극적으로 전사 인자에 정액 일에서 파생됩니다 DNA 상호 작용 1,2,하지만 sensiti에 개선의 번호를 통합하기 어려운 얻을 세포 유형에 대한 VITY 및 재현성. 프로토콜이 성공적으로 사용되어왔다 3,4, DNA 농축을 정량화하기 qPCR에 사용하거나, 아래의 프로토콜의 반 정량적 인 변형을 사용하여 두.
PCR 증폭 물질이 정량적 분석은 계산 수행 및 분석에 제한 요소를 나타냅니다. 중요한 컨트롤 및 기타 고려 사항에 따라 변경을 표시하지 않는 등 연구중인 단백질 (또는 예상에 구속되지 않도록 예측 intergenic 지역으로 이소 타입을 맞춘 항체의 사용뿐만 아니라 게놈 DNA의 제어 영역의 평가를 포함 실험 조건). 또한, 모든 칩 샘플에 대한 입력 자료의 표준 곡선은 실험 물질에 농축의 절대 수준을 도출하는 데 사용됩니다. 표준 곡선의 사용에 관계없이 설계하는 방법을주의 깊게의 프라이머 세트 사이에 계정의 차이를 고려하고, 또한 효율이 다를 수 있습니다하나의 프라이머 세트에 대한 템플릿 농도의 범위에 걸쳐 ences. 우리 프로토콜은 우리가 광범위 나중에 분석 단계를 포함한다는 점에서 5-8 사용할 수있는 다른 사람과 다른 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜은 위에 정확하게 칩을 사용하여 기본 림프구의 DNA 농축을 정량화하는 강력한 방법을 제공합니다. 이 프로토콜의 안정성에 대한 하나의 주요 이유는 생물학적가 복제를 포함합니다. 위의 프로토콜은 세 가지가 독립적으로 계산되는 농축을 복제합니다. 출력은 다음 농축과 변화의 측정을 제공하기 위해 계산 된 표준 편차의 정도를 제공하기 위해 평균한다. 각 샘플은 세 가지 기술은 또?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 보조금 CA141009 및 GM39067에 의해 지원되었다. 우리는 기록 된 부분에 의견을 E. 파넬 (Parnell)과 R. Yarrington 감사합니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Formaldehyde | Sigma | F-8775 | Store at RT |
| Phosphate Buffered Saline | Hyclone | SH30256.01 | Store at 4 °C |
| Protease Inhibitor tablets | Roche | 04693116001 | Store at 4 °C |
| Protein G magnetic beads | Active Motif | 101945 | Store at 4 °C |
| RNase A (20 mg/ml) | EMD Millipore | 556746 | Store at -20 °C |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Roche | 03115879001 | Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0 |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966-034 | Store at -20 °C |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7567 | Store at -20 °C |
| 1 M Glycine | Store at RT | ||
| Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40) | Store at 4 °C | ||
| Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS) | Store at RT | ||
| ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
| Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
| High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
| LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0) | Store at 4 °C | ||
| TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA) | Store at 4 °C | ||
| Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3) | Prepare fresh | ||
| 5 M NaCl | Store at RT | ||
| 0.5 M EDTA | Store at RT | ||
| 1 M Tris-HCl, pH 6.5 | Store at RT | ||
| Table of Specific Reagents | |||
| Clay Adams Brand Nutator | Becton Dickinson | Model: 421105 | |
| Magnetic Stand | Promega | Z5342 | |
| Qiaquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Masonix Sonicator 3000 | QSonica | Model: S3000 | |
| UV Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 | |
| Heating Block | VWR | 13259-030 | |
| Rotator | VWR | 80085-692 | |
| Refrigerated bench top centrifuge | Beckman Coulter | Model: Allegra X-12R | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Table of Equipment |
Referencias
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