Biyokütle Limit Tutarlar kullanarak Verimli Kromatin Immunoprecipitation
Summary
Biz primer T hücreleri kullanarak kromatin immunoprecipitation için bir sağlam bir yöntem tarif. Metodu standart yaklaşımlar üzerine kurulmuştur, ama hücrelerin sınırlı bir miktarda için verimliliği artırmak koşulları ve reaktifler belirli bir kümesi kullanır edilir. Önemli olarak, veriler analiz aşaması bölgesinin, bir ayrıntılı bir açıklama sunulmaktadır edilir.
Abstract
Kromatin immunoprecipitation (ChIP) canlı hücrelerinin kromatin DNA ile farklı proteinlerin etkileşimleri belirlemek için bir yaygın olarak-kullanılan bir yöntemdir. Örnekleri arasında belli bir sekansa özel DNA bağlanma transkripsiyon faktörleri, histon ve onların farklı bir değişiklik Birleşik Devletleri, bu tür, RNA polimeraz ve ancillary faktörler olarak enzimler, ve DNA onarım bileşenleri yer alıyor. Onun aynı anda her yerde rağmen, malzeme her iki tezgah hazırlanması için ve etkileşim kantitatif ölçümlerini izin veren doğru analiz için kadar-to-date, ayrıntılı metodolojileri bir eksikliği vardır. Bu bilgi eksikliği nedeniyle, ve aynı zamanda herhangi bir immünopresipitasyon gibi, koşullar deneysel koşullar yeni setleri için yeniden-optimize edilmiş olmalıdır, çünkü, ChIP tahlil yanlış veya kötü kantitatif sonuçlar karşı hassastır.
Bizim protokolü sonuçta transkripsiyon faktörü üzerinde ufuklar açan işten türetilmiştir: DNA etkileşimleri 1,2, ama sensitizasyon için bir dizi iyileştirme içerirzor-to-elde hücre tipleri için vite ve tekrarlanabilirlik. Protokol başarılı bir şekilde kullanılır olmuştur 3,4, DNA zenginleştirme ölçmek için qPCR kullanarak, ya da altında protokolün bir yarı-nicel varyant kullanarak her iki.
PCR-amplifiye malzeme bölgesinin Bu, kantitatif analiz hesaplama açısından ısırttı, ve tahlil otelinin, bir kısıtlayıcı bir faktör temsil eder edilir. Önemli kontroller ve diğer hususlar uygulaması sonucunda oluşan değişiklikleri göster: Aile bulundunuz değil, böyle bir çalışmada altındaki bir protein (ya da beklenen edenler tarafından bağlı olmayı bulundunuz olmayacağı tahmininde bulundu, bir intergenik bir bölge olarak bir izotip-eşlemeli antikor bölgesinin kullanımı, hem de olarak kullanmak genomik DNA'nın bölgesinin, bir kontrol bölgesi bölgesinin değerlendirmesi, tüm , deneysel şartları yaratarak). Buna ek olarak, her bir ChIP örnek için giriş malzeme bölgesinin, bir standart bir eğri deneme girdileri ve materyaldeki açısından önemli ölçüde zenginleşme bölgesinin mutlak düzeyleri aç türetmek için kullanılır edilir. Standart eğrileri kullanımı ne olursa olsun onlar tasarlanmış nasıl dikkatli bir şekilde ki, primer setleri arasındaki hesabınıza farklılıkları içine almak, ve aynı zamanda verimlilik farklılık için yardımcı olurbir tek bir astar kümesi için şablon konsantrasyonlarının aralığı boyunca referanslarınıza. Bizim protokolü biz yoğun bir şekilde daha sonra, analiz aşamasında kapsayacak bu içinde 5-8 mevcuttur diğerlerinden farklıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol Yukarıdaki doğru bir şekilde ChIP kullanarak birincil Lenfositlerden elde DNA zenginleştirme miktarının bir sağlam bir yöntem sağlar. Bu protokolde sağlamlık için bir önemli nedeni biyolojik çoğaltır dahil edilmesi. , Yukarıda bulunan iletişim kuralı üç, bağımsız bir şekilde hesaplanır, hangi için en zenginleştirme çoğaltır kullanır. Çıkışlar daha sonra zenginleşme, ve değişkenliği bölgesinin sağlamak için bir önlem hesaplanan standart sapma daha bölgesinin bir ölç…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH hibe CA141009 ve GM39067 tarafından desteklenmiştir. Biz yazılı kısmı yapılan yorumlar için E. Parnell ve R. Yarrington teşekkür ederim.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Formaldehyde | Sigma | F-8775 | Store at RT |
| Phosphate Buffered Saline | Hyclone | SH30256.01 | Store at 4 °C |
| Protease Inhibitor tablets | Roche | 04693116001 | Store at 4 °C |
| Protein G magnetic beads | Active Motif | 101945 | Store at 4 °C |
| RNase A (20 mg/ml) | EMD Millipore | 556746 | Store at -20 °C |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Roche | 03115879001 | Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0 |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966-034 | Store at -20 °C |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7567 | Store at -20 °C |
| 1 M Glycine | Store at RT | ||
| Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40) | Store at 4 °C | ||
| Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS) | Store at RT | ||
| ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
| Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
| High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl) | Store at 4 °C | ||
| LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0) | Store at 4 °C | ||
| TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA) | Store at 4 °C | ||
| Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3) | Prepare fresh | ||
| 5 M NaCl | Store at RT | ||
| 0.5 M EDTA | Store at RT | ||
| 1 M Tris-HCl, pH 6.5 | Store at RT | ||
| Table of Specific Reagents | |||
| Clay Adams Brand Nutator | Becton Dickinson | Model: 421105 | |
| Magnetic Stand | Promega | Z5342 | |
| Qiaquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Masonix Sonicator 3000 | QSonica | Model: S3000 | |
| UV Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 | |
| Heating Block | VWR | 13259-030 | |
| Rotator | VWR | 80085-692 | |
| Refrigerated bench top centrifuge | Beckman Coulter | Model: Allegra X-12R | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Table of Equipment |
Referencias
- Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters. Molecular and Cellular Biology. 21, 6820-6832 (2001).
- Weinmann, A. S., Farnham, P. J. Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods. 26, 37-47 (2002).
- Li, Q., et al. Constitutive nuclear localization of NFAT in Foxp3+ regulatory T cells independent of calcineurin activity. J. Immunol. 188, 4268-4277 (2012).
- Shakya, A., Kang, J., Chumley, J., Williams, M. A., Tantin, D. Oct1 is a switchable, bipotential stabilizer of repressed and inducible transcriptional states. The Journal of Biological Chemistry. 286, 450-459 (2011).
- Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).
- Lubelsky, Y., Macalpine, H. K., Macalpine, D. M. Genome-wide localization of replication factors. Methods. 57, 187-195 (2012).
- O’Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nature Genetics. 38, 835-841 (2006).
- Sikes, M. L., et al. A streamlined method for rapid and sensitive chromatin immunoprecipitation. Journal of Immunological Methods. 344, 58-63 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4, 651-657 (2007).
