La transfección de proteínas de ratón de pulmón

Resumen

Los ratones transgénicos o vectores virales se han utilizado para aumentar la expresión de la proteína en el pulmón. Sin embargo, estas técnicas son mucho tiempo, y técnicamente difícil tener efectos fuera de objetivo que pueden confundir los resultados. Nuestro protocolo de transfección de proteína utiliza un reactivo de transfección basado en lípidos y un microsprayer ultrafino para entregar de manera uniforme proteína activa a las células pulmonares.

Resumen

El aumento de la expresión de proteínas permite a los investigadores a entender mejor el papel funcional de esta proteína en la regulación de procesos biológicos clave ^1. En el pulmón, esto se ha logrado típicamente a través de enfoques genéticos que utilizan ratones transgénicos ^2,3 o vectores virales o no virales que elevan los niveles de proteína a través de aumento de la expresión del gen ^4. Los ratones transgénicos son costosos y requiere mucho tiempo para la generación y la inserción aleatoria de un gen de expresión del transgen o crónica pueden alterar el desarrollo normal de los pulmones y por lo tanto limitar la utilidad del modelo ^5. Mientras que los transgénicos condicionales evitar problemas asociados con la expresión crónica gen ^6, los ratones transactivador controlado por tetraciclina inverso (rtTA), que se utilizan para generar la expresión condicional, se desarrollan espontánea aire ampliación espacio ^7. Al igual que con los transgénicos, el uso de vectores virales y no virales es caro ⁸ y puede provocar dosis-drespuestas inflamatorias ependent que confunden los resultados ⁹ y dificultan la expresión ^10. Por otra parte, la eficacia de las dosis repetidas están limitados por las respuestas inmunes mejoradas a el vector de ^11,12. Los investigadores están desarrollando adeno-asociado vectores virales (AAV) que provocan una menor inflamación y tener una expresión más larga dentro del pulmón ^13.

Uso de β-galactosidasa, se presenta un método para incrementar la expresión rápida y eficazmente la proteína dentro del pulmón utilizando una técnica directa de transfección de proteína. Este protocolo se mezcla una cantidad fija de proteína purificada con 20 l de un reactivo de transfección a base de lípidos (Pro-Ject, Pierce Bio) para permitir la penetración en el tejido pulmonar en sí. La mezcla de proteína liposómica se inyecta entonces en los pulmones de los ratones a través de la tráquea utilizando un microsprayer (Penn Century, Filadelfia, PA). El microsprayer genera una fina nube de aerosol líquido a través de los pulmones. Utilizando la técnicahemos demostrado la deposición uniforme de la proteína inyectada a través de las vías respiratorias y los alvéolos de los ratones ^14. La técnica de transfección de lípidos permite el uso de una pequeña cantidad de proteína para lograr el efecto. Esto limita la respuesta inflamatoria que de otro modo sería provocado por alta administración de la proteína. En efecto, el uso de esta técnica hemos publicado que hemos sido capaces de aumentar significativamente la actividad de PP2A en el pulmón sin afectar pulmón celularidad lavado ^15. Lavado pulmonar celularidad tomada 24 horas después de la exposición fue comparable a los controles (27 ± 4 Control vs 31 ± 5 albúmina transfectadas, N = 6 por grupo). Además, aumenta los niveles de proteína sin inducir cambios en el desarrollo del pulmón o cambios en la arquitectura que pueden ocurrir en modelos transgénicos. Sin embargo, la necesidad de administraciones repetidas puede hacer esta técnica menos favorable para los estudios que examinan los efectos de los aumentos a largo plazo en la expresión de la proteína. Esto sería particularmente true de las proteínas con una vida media corta.

Protocolo

1. Preparación de Proteína reactivo de transfección

1. Disolver el reactivo Pro-Ject mediante la adición de 250 l de metanol o cloroformo al tubo que contiene la película seca.
2. Vortex durante 10-20 segundos a velocidad máxima.
3. Pipetear 20 l de reactivo de Pro-Ject en tubos de microcentrífuga separados.
4. Evaporar el disolvente mediante la colocación de los tubos de microcentrífuga que contiene el reactivo Pro-Ject bajo una campana de flujo laminar durante un mínimo de 6 horas a temperatura ambiente. Debe estar completamente seco. Alternativamente, secar el reactivo Pro-Ject utilizando un secador de vacío.
5. Guarde los tubos....

Resultados

Para demostrar la eficacia de nuestra técnica se utilizó una microsprayer (Penn Century) para inyectar la tráquea de los ratones con 2 mg de albúmina de ratón (Sigma) disuelto en 50 l de PBS que contenía 20 l de reactivo de transfección Pro-Ject. Los ratones tratados con albúmina se compararon con ratones que fueron tratados de manera idéntica con 2 g de proteína beta-galactosidasa (Pierce Bio). Después de veinticuatro horas los ratones fueron sacrificados y los pulmones se procesaron para el análisis histológico........

Discusión

La ventaja de esta técnica sobre otros métodos es que produce aumentos en los niveles de proteína y la actividad en el tejido pulmonar en sí. Por otra parte, penetra a las regiones más distales del pulmón en lugar de alojarse sólo dentro de las vías respiratorias. Hemos medido aumento de la actividad de proteínas de nuestra inyectado incluso después lavaging las vías respiratorias con solución salina ^15. Los análisis de actividad del tejido indican que la proteína está entrando en las células y no sólo perman.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pro-Ject	Pierce Bio	89850
Micropulverizador	Penn Century	FMJ-250
Beta-galactosidasa	Pierce Bio	89850
Anticuerpo beta-galactosidasa	Santa Cruz Bio	SC-19119
Albúmina sérica de ratón	Sigma Aldrich	A3139
Ketamina/xilacina	Sigma Aldrich	K113