Transfection החלבון של ריאות מאוס
Summary
עכברים מהונדסים או וקטורים נגיפיים היו בשימוש כדי להגדיל את ביטוי חלבון בתוך הריאה. עם זאת, הטכניקות האלה הן זמן רב, מאתגרים מבחינה טכנית ויש השפעות מחוץ היעד שיכול לבלבל את התוצאות. פרוטוקול transfection שלנו משתמש בחלבון מגיב transfection מבוסס שומנים וmicrosprayer ultrafine כדי לספק חלבון פעיל באופן אחיד לתאי ריאה.
Abstract
הגדלת ביטוי חלבון מאפשרת לחוקרים להבין טובים יותר את התפקיד הפונקציונלי של חלבון זה בויסות תהליכים ביולוגיים מרכזיים 1. בסרטן הריאות, זה הושג בדרך כלל באמצעות גישות גנטיות המנצלות עכברים הטרנסגניים 2,3 או וקטורים ויראליים או לא ויראלי שמעלים רמות חלבון דרך ביטוי גנים מוגבר 4. עכברים מהונדסים הם יקרים וגוזלים זמן ליצירה וההחדרה של ביטוי transgene או כרוני גנטי האקראית יכולה לשנות את התפתחות ריאות נורמלית ובכך להגביל את התועלת של מודל 5. בעוד transgenics המותנה למנוע בעיות הקשורות לביטוי כרוני גן 6, את transactivator (rtTA) עכברי טטרציקלין שהשליטה ההפוכים, שמשמשים ליצירת ביטוי תנאי, לפתח הגדלת מרחב אווירי ספונטנית 7. כמו עם transgenics, השימוש בוקטורים ויראליים ולא ויראלי הוא יקר 8 ויכול לעורר מינון-Dתגובות דלקתיות ependent הרודפות את התוצאות 9 ולעכב את הביטוי 10. יתר על כן, היעילות של מינונים חוזרים ונשנים הן מוגבלת על ידי תגובה חיסונית משופרת לווקטור 11,12. חוקרים מפתחים adeno הקשורים וקטורים (AAV) יראליות שיעוררו פחות דלקות ולהיות ביטוי ארוך יותר בתוך הריאות 13.
באמצעות β-גלקטוזידאז, אנו מציגים שיטה לביטוי חלבון גדל במהירות וביעילות בתוך הריאות באמצעות טכניקת transfection חלבון ישירה. פרוטוקול זה מערבב כמות קבועה של חלבון מטוהר עם 20 μl של מגיב transfection מבוסס שומנים (Pro-JECT, פירס ביו) כדי לאפשר חדירה לתוך רקמת הריאה עצמה. תערובת חלבוני liposomal לאחר מכן הוזרקה לריאות של העכברים באמצעות קנה הנשימה באמצעות microsprayer (פן המאה, פילדלפיה, פנסילבניה). Microsprayer יוצר פלומה דקה של תרסיס נוזלי לאורך הריאות. באמצעות הטכניקהאנו הוכחנו בתצהיר אחיד של החלבון המוזרק לאורך כל דרכי הנשימה ואת alveoli של עכברים 14. טכניקת transfection השומנים מאפשרת שימוש בכמות קטנה של חלבון כדי להשיג את האפקט. זה מגביל את התגובה הדלקתית שאחרת היה עוררה על ידי ממשל חלבון גבוה. ואכן, שימוש בטכניקה זו שפרסמנו כי הצלחנו להגדיל את הפעילות בPP2A הריאות באופן משמעותי מבלי להשפיע על ריאות תאיות שטיפת 15. cellularity שטיפת הריאות נלקחו 24 שעות לאחר האתגר היה דומה לקבוצת ביקורת (27 ± 4 שליטה לעומת 31 ± 5 transfected אלבומין, n = 6 לכל קבוצה). יתר על כן, הוא מגביר את רמות חלבון ללא גרימת שינויים התפתחותיים ריאה או שינויים ארכיטקטוניים שיכול להתרחש במודלים מהונדסים. עם זאת, את הצורך בממשלים חוזרים ונשנים עלול להפוך טכניקה זו פחות נוחה למחקרים הבוחנים את ההשפעות של עלייה ארוכת טווח בביטוי חלבון. זה יהיה בעיקר Truדואר לחלבונים עם זמן מחצית חיים קצרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
היתרון של שיטה זו על פני שיטות אחרות הוא שזה מייצר עליות ברמות חלבון ופעילות בתוך רקמת הריאה עצמה. יתר על כן, זה חודר לאזורים המרוחקים ביותר של הריאות בניגוד להישאר רק בתוך את דרכי הנשימה. יש לנו למדוד פעילות מוגברת של חלבון injectate גם לאחר lavaging איירווייס עם 15 מלוחי…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות (7R01HL098528-03) ופרס הממציא הקליני של FAMRI.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Pro-Ject | Pierce Bio | 89850 | |
| Microsprayer | Penn Century | FMJ-250 | |
| Beta-galactosidase | Pierce Bio | 89850 | |
| Beta-galactosidase antibody | Santa Cruz Bio | SC-19119 | |
| Mouse serum albumin | Sigma Aldrich | A3139 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma Aldrich | K113 |
Referencias
- Glasser, S. W., Korfhagen, T. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Transgenic models for study of pulmonary development and disease. Am. J. Physiol. 267, 489-497 (1994).
- D’Armiento, J., Dalal, S. S., Okada, Y., Berg, R. A., Chada, K. Collagenase expression in the lungs of transgenic mice causes pulmonary emphysema. Cell. 71, 955-961 (1992).
- Foronjy, R. F., et al. Superoxide dismutase expression attenuates cigarette smoke- or elastase-generated emphysema in mice. Am. J. Respir Crit. Care Med. 173, 623-631 (2006).
- Foronjy, R., et al. The divergent roles of secreted frizzled related protein-1 (SFRP1) in lung morphogenesis and emphysema. Am. J. Pathol. 177, 598-607 (2010).
- Costa, R. H., Kalinichenko, V. V., Lim, L. Transcription factors in mouse lung development and function. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 280, 823-838 (2001).
- Perl, A. K., Tichelaar, J. W., Whitsett, J. A. Conditional gene expression in the respiratory epithelium of the mouse. Transgenic Research. 11, 21-29 (2002).
- Morimoto, M., Kopan, R. rtTA toxicity limits the usefulness of the SP-C-rtTA transgenic mouse. Dev. Biol. 325, 171-178 (2009).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nature reviews. Genetics. 8, 573-587 (2007).
- Crystal, R. G., et al. Administration of an adenovirus containing the human CFTR cDNA to the respiratory tract of individuals with cystic fibrosis. Nat. Genet. 8, 42-51 (1994).
- Merkel, O. M., Zheng, M., Debus, H., Kissel, T. Pulmonary gene delivery using polymeric nonviral vectors. Bioconjugate Chemistry. 23, 3-20 (2012).
- Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. J. Virol. 69, 2004-2015 (1995).
- Liu, Q., Muruve, D. A. Molecular basis of the inflammatory response to adenovirus vectors. Gene Ther. 10, 935-940 (2003).
- Pfeifer, C., Aneja, M. K., Hasenpusch, G., Rudolph, C. Adeno-associated virus serotype 9-mediated pulmonary transgene expression: effect of mouse strain, animal gender and lung inflammation. Gene Ther. 18, 1034-1042 (2011).
- Wallace, A. M. Protein phosphatase 2A regulates innate immune and proteolytic responses to cigarette smoke exposure in the lung. Toxicol. Sci. 126, 589-599 (2012).
- Wallace, A. M. Protein Phosphatase 2a (Pp2a) Regulates Innate Immune and Proteolytic Responses to Cigarette Smoke Exposure in the Lung. Toxicol. Sci. , (2012).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J. Appl. Physiol. 87, 2362-2365 (1999).
