마우스 폐의 단백질 형질
Summary
형질 전환 마우스 또는 바이러스 성 벡터는 폐 내의 단백질 발현을 증가하는 데 사용되었습니다. 그러나이 기술은 기술적으로 도전적인 시간이 소요하고 결과를 혼동 할 수 있습니다 떨어져 표적 장기에 주요 영향이있다. 우리의 단백질 형질 프로토콜은 지질 기반의 transfection 시약 및 균일 폐 세포에 활성 단백질을 제공하는 초 미세 microsprayer을 사용합니다.
Abstract
단백질 발현을 증가하는 것은 연구자가 더 중요한 생물 학적 과정 1 조절에 그 단백질의 기능 역할을 이해 할 수 있습니다. 폐에서이 유전자 발현을 증가 4를 통해 단백질 수준을 상승 형질 전환 생쥐 2,3 또는 바이러스 성 또는 비 바이러스 성 벡터를 활용 유전 방식을 통해 일반적으로 달성되었다. 형질 전환 생쥐를 생성하는 비용과 시간이 많이 소요하고 유전자 또는 만성 유전자 발현의 임의 삽입은 정상 폐 발달을 변경하고 따라서 모델 5의 유틸리티를 제한 할 수 있습니다. 조건식을 생성하는 데 사용되는 만성 유전자 발현 6, 반대 테트라 사이클린 제어 transactivator (rtTA) 마우스와 관련된 문제 AVERT 조건부 형질 전환은 자연 공기 공간 확대 7을 개발하면서. 형질 전환과 마찬가지로, 바이러스 성 및 비 바이러스 성 벡터의 사용은 8 비싸고 용량-D를 자극 할 수그 ependent 염증 반응 결과 9 혼란과 표현 10을 방해. 또한, 반복 투여의 효능은 벡터 11,12 향상 면역 반응에 의해 제한됩니다. 연구진은 적은 염증을 유발하고 폐 13에서 더 이상 표현이 아데노 – 관련 바이러스 (AAV) 벡터를 개발하고 있습니다.
β-갈 락토시다 아제를 사용하여, 우리는 직접 단백질 형질 전환 기술을 사용하여 폐 내에서 신속하고 효율적으로 증가하는 단백질 발현을위한 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 폐 조직 자체에 침투를 허용하는 지질 기반 형질 시약 20 μL (프로 피사체, 피어스 바이오)와 단백질을 정제 고정 된 금액을 섞는다. 리포좀 단백질 혼합물은 microsprayer (펜 세기, 필라델피아, PA)를 사용하여 기관을 통해 생쥐의 폐에 주입된다. microsprayer은 폐를 통해 액체 에어로졸의 벌금 깃털을 생성합니다. 기술을 사용하여우리는기도와 마우스 (14)의 폐포에 걸쳐 주입 단백질의 균일 한 증착을 증명하고있다. 지질 형질 전환 기술은 효과를 달성하기 위해 단백질의 소량 사용할 수 있습니다. 이 그렇지 않은 고단백 관리에 의해 자극 될 것이다 염증 반응을 제한합니다. 사실,이 기술 사용하여 우리는 우리가 크게 폐 세척 세포질 15에 영향을주지 않고 폐에 PP2A 활동을 증가시킬 수 있다고 발표했다. 공격 후 24 시간을 촬영 한 폐 세척의 세포질은 컨트롤에 비교했다 (27 ± 31 대 4 제어 ± 5 알부민, 형질 전환, N 그룹 당 = 6). 또한, 형질 전환 모델에서 발생할 수있는 폐 발달 변경이나 아키텍처 변경을 유도하지 않고 단백질 수준을 증가시킵니다. 그러나 반복 투여의 필요성 단백질 발현에 장기적인 증가의 효과를 조사 연구를위한이 기술은 불리한 만들 수 있습니다. 특히 트루 것짧은 반감기를 가진 단백질에 대한 전자.
Protocol
Representative Results
Discussion
다른 방법에 비해이 기술의 장점은 폐 조직 자체 내에서 단백질 수준과 활동의 증가를 생성하는 것입니다. 또한, 그것은 단지기도 내에 체류 반대로 폐의 가장 말단 지역에 침투합니다. 우리는 심지어 생리 식염수 15기도 lavaging 후 injectate 증가 단백질의 활동을 측정했다. 조직 활동 분석은 단백질이 세포를 입력하고 단지 마우스의 공기 공간에 남아 있지 않는 것을 나타냅니다. 이 또?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 보건원 (7R01HL098528-03)와 FAMRI의 임상 혁신 상 수상에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Pro-Ject | Pierce Bio | 89850 | |
| Microsprayer | Penn Century | FMJ-250 | |
| Beta-galactosidase | Pierce Bio | 89850 | |
| Beta-galactosidase antibody | Santa Cruz Bio | SC-19119 | |
| Mouse serum albumin | Sigma Aldrich | A3139 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma Aldrich | K113 |
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