微生物システム生物学のケモスタットの使用
Summary
細胞増殖速度が調節されたプロセスおよび細胞生理学の主要な決定因子である。ケモスタットを用いた連続培養は、細胞増殖およびどのようにそれらのネットワークは細胞増殖を最適化するために進化を制御する分子ネットワークの研究を促進する栄養制限することにより、細胞増殖速度の外因性の制御を可能にする。
Abstract
細胞は、外界からの信号に応答してそれらの成長速度を調節する。細胞の成長に合わせて、多様な細胞プロセス、高分子合成、代謝や細胞分裂周期に最終的には、コミットメントなど、調整する必要があります。細胞増殖の速度を制御する調節ネットワーク – 遺伝子発現および代謝を含む – ケモスタット実験的細胞増殖速度を制御する方法は、系統的にどのように成長速度に影響を与える細胞プロセスを研究する強力な手段を提供する。世代ケモスタット数百のために維持するとき、細胞増殖を制限する環境条件における微生物の適応進化を研究するために使用することができる。我々は、ケモスタット培養の原理を記載し、それらの動作を示し、それらの様々なアプリケーションの例を提供する。 20世紀半ばの発売後の廃用の期間の後、に新たにゲノムスケール手法の収束terest細胞の成長および適応進化の分子基盤の調節に生物学的研究におけるケモスタットを使用することにルネサンスを刺激されている。
Introduction
細胞の増殖は、遺伝因子と環境因子の相互作用の1,2複雑なネットワークによって調節される。細胞増殖の調節多因子は、その研究にシステムレベルのアプローチを必要とする。しかし、調節された細胞成長の厳密な研究は、実験的に細胞が成長する速度を制御することの困難性により攻撃される。また、最も単純な実験で、細胞外の条件は、彼らが増殖するように細胞が継続的にその環境を変えるように、頻繁にダイナミックで複雑です。定義された、不変かつ制御された環境における細胞増殖速度の実験的な制御を可能にする細胞を培養する方法であって、これらの問題に対する解決策を、ケモスタットによって提供される。
ケモスタットを用いて連続培養する方法は、独立して1950年にモノー3とNovick＆シラード4で記述されていた。もともと構想として、細胞をCONのメディアの一定体積で栽培されているtinually新しいメディアと古い培地および細胞の同時除去（ 図1）の添加により希釈した。結合した常微分方程式（ 図2）のセル密度（x）およびケモスタット容器中の増殖制限栄養素（単数または複数 ）の濃度の変化率を記述する。重要なことに、この連立方程式は、定常状態で、細胞（ すなわち 、指数増殖速度定数）の特異的増殖速度は、速度に等しいことを顕著含意を有する単一の（非ゼロの）安定した定常状態（ 図3）を予測れる培養物（D）希釈する。希釈率を変えることにより、異なる成長速度でかつ栄養制限の異なる条件下での細胞の定常状態の集団を確立することが可能である。
ケモスタットを使用して、成長率の実験的制御がどのように細胞生理学の変化の理解の発展に重要であった成長5,6のレートで。しかし、微生物学的方法のかつての主力は、20世紀後半の間の分子生物学研究の爆発の際にますますあいまいになりました。今日では、微生物および多細胞生物の両方で増殖制御に関心をリニューアルし、システムレベルの解析のためのゲノム規模法の出現は、ケモスタットを使用するためのモチベーションをリニューアルしました。ここでは、細胞増殖速度の正確な制御とケモスタットを使用して一意に可能な外部環境を生かす3つのアプリケーションについて説明します。このような転写産物および代謝産物など – – 協調的な成長率で規制されている第一に、我々は、生体分子の何千もの豊富さは、どのように調査するケモスタットの使用を記載している。第二に、我々はケモスタットは、競合実験を用いて、栄養素が制約された環境では、異なる遺伝子型の間の成長率の差の正確な推定値を得るために使用することができる方法を記載している。第三に、我々はどのようにケモスタットができる記述一定の貧栄養環境下で増殖する細胞の適応進化を研究するために使用される。これらの例は、ケモスタット環境相互作用および適応進化による細胞増殖調節遺伝子のシステム·レベルの調査を可能にされる方法を例示する。
Protocol
ケモスタットを用いて連続培養の原理は、様々な実装を実現することができる。すべてのケモスタットでは、すべてのコンポーネント、2）十分に混合培養、培養容器の3）適切な通気、4）メディアのほか、文化除去の信頼できる手段の無菌性を維持するための1）の方法を持っていることが不可欠である。ここでは、簡単に代替のセットアップに適合させることができる方法を使用して、ケモ…
Representative Results
ケモスタットの主な利点は、希釈率を変化させることによって実験的に細胞の増殖速度を制御する能力である。出芽酵母、サッカロマイセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）においては、細胞の形態、細胞分裂周期におけるその位相の情報である。 unbudded細胞（ 図5A）の割合を測定することによって決定されるように、より高い成長速度を有する集団は、活発に分裂する細胞の…
Discussion
ケモスタットは、成長制御の定常状態での微生物の培養を可能にする。細胞は不変外部環境になり、一定の速度で継続的に成長する。これは、外部環境が連続的に変化しており、細胞増殖速度は、環境と遺伝子型の複雑な相互作用により決定されたバッチ培養法とは対照的である。したがって、バッチ培養上ケモスタット中の微生物を培養するの主な利点は、実験的に、細胞の増殖速度を制?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ニューヨーク大学のフォームの起動の資金によってサポートされていました。我々は当初、ケモスタットとしてSixforsバイオリアクターの使用を開発し弥勒ダナムとマットブラウアーに感謝します。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Infors-HT Sixfors Chemostat | Appropriate Technical Resources, Inc. | ||
| Glass Bottle 9.5 L | Fisher Scientific | 02-887-1 | For Media Vessel and Hosing |
| Pinchcock | Fisher Scientific | 05-867 | For Media Vessel and Hosing |
| Stopper, Size 12, Green Neoprene | Cole-Palmer | EW-62991-42 | For Media Vessel and Hosing |
| Straight Connector | Cole-Palmer | EW-30703-02 | For Media Vessel and Hosing |
| General purpose ties 4 in | Fisher Scientific | NC9557052 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone Rubber | Small Parts | B000FMWTDE | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 3/8 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1Q | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 7/32 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1E | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD | McMaster-Carr | 6100K164 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD | McMaster-Carr | 6100K161 | For Media Vessel and Hosing |
| Hook Connectors | Fisher Scientific | 14-66-18Q | For Media Vessel and Hosing |
| Ratchet Clamp | Cole-Palmer | EW-06403-11 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Female | Cole-Palmer | EW-45512-34 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Male | Cole-Palmer | EW-45513-04 | For Media Vessel and Hosing |
| Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm | Fisher Scientific | MTGR05010 | For Media Vessel and Hosing |
| PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm | Fisher Scientific | NC9131037 | For Media Vessel and Hosing |
| Direct-Reading Flowtube for Air | Cole-Palmer | EW-32047-77 | For Nitrogen Gas Setup |
| Direct-Reading Flowtube for Nitrogen | Cole-Palmer | EW-32048-63 | For Nitrogen Gas Setup |
| Gas Proportioner Multitube Frames | Cole-Palmer | EW-03218-50 | For Nitrogen Gas Setup |
| Regulator, Two-Stage Analytical | Airgas | Y12-N145D580 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Adaptor, Stainless Steel | Airgas | Y99-26450 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Male Adaptor | Airgas | WES544 | For Nitrogen Gas Setup |
| Norprene Tubing | US Plastics | 57280 | For Nitrogen Gas Setup |
| Tripod Base | Cole-Palmer | EW-03218-58 | For Nitrogen Gas Setup |
| Valve Cartridges | Cole-Palmer | EW-03217-92 | For Nitrogen Gas Setup |
| Carboy 10 L | Fisher Scientific | 02-963-2A | For Media Preperation |
| Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size | Fisher Scientific | SCGP-T10-RE | For Media Preperation |
| Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size | Fisher Scientific | FB-800-100 | For Media Preperation |
| calcium chloride·2H2O | Fisher Scientific | C79-500 | Media Reagents |
| sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | Media Reagents |
| magnesium sulfate·7H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | AC424205000 | Media Reagents |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | AC423400010 | Media Reagents |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | Media Reagents |
| boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Media Reagents |
| copper sulfate·5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Media Reagents |
| potassium iodide | Sigma Aldrich | 60400 | Media Reagents |
| ferric chloride·6H2O | Fisher Scientific | I88-100 | Media Reagents |
| manganese sulfate·H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| sodium molybdate·2H2O | Sigma Aldrich | M7634 | Media Reagents |
| zinc sulfate·7H2O | Fisher Scientific | Z68-500 | Media Reagents |
| biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | Media Reagents |
| calcium pantothenate | Fisher Scientific | AC24330-1000 | Media Reagents |
| folic acid | Sigma Aldrich | F7876 | Media Reagents |
| inositol (aka myo-inositol) | Fisher Scientific | AC12226-1000 | Media Reagents |
| niacin (aka nicotinic acid) | Sigma Aldrich | N4126 | Media Reagents |
| p-aminobenzoic acid | Fisher Scientific | AC14621-2500 | Media Reagents |
| pyridoxine HCl | Sigma Aldrich | P9755 | Media Reagents |
| riboflavin | Sigma Aldrich | R4500-25G | Media Reagents |
| thiamine HCl | Fisher Scientific | BP892-100 | Media Reagents |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000-100G | Media Reagents |
| Uracil | Sigma Aldrich | U0750 | Media Reagents |
| Dextrose | Fisher Scientific | DF0155-08-5 | Media Reagents |
Referencias
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Citar este artículo
Ziv, N., Brandt, N. J., Gresham, D. The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology. J. Vis. Exp. (80), e50168, doi:10.3791/50168 (2013).