미생물 시스템 생물학의 Chemostats의 사용
Summary
세포의 성장 속도는 규제 과정 및 세포 생리학의 주요 결정 요인이다. chemostats를 이용한 연속 배양은 세포 성장과 이러한 네트워크는 세포 성장을 최적화하기 위해 발전을 제어하는 분자 네트워크의 학습을 용이 영양소 한정하여 세포 성장 속도의 외인성 제어를 가능하게한다.
Abstract
세포는 외부 세계로부터의 신호에 응답하여 자신의 성장의 속도를 조절한다. 세포가 성장함에 따라, 다양한 세포 과정은 고분자 합성, 신진 대사와 세포 분열주기에 궁극적으로 책임 등 조정해야합니다. chemostat 실험적으로 세포의 성장 속도를 제어하는 방법은, 체계적 연구의 강력한 수단을 제공하는 방법 성장률 영향 세포 과정 – 세포의 성장 속도를 제어 규제 네트워크 – 유전자 발현 및 대사 등. 세대 chemostats 수백 유지하면 세포 성장을 제한하는 환경 조건에서 미생물의 적응 적 진화를 연구하기 위해 사용될 수있다. 우리는 chemostat 문화의 원리를 설명하는 자신의 작업을 설명하고 그들의 다양한 응용 프로그램의 예를 제공합니다. 20 세기 중반에 소개 된 후 폐기의 기간을 다음과 게놈 규모의 방법론의 융합은 리뉴얼의 terest 세포의 성장과 적응 진화의 분자 기준의 규정에 생물학 연구에 chemostats의 사용에 르네상스를 자극한다.
Introduction
세포의 성장은 유전과 환경 요인의 1,2 상호 작용의 복잡한 네트워크에 의해 조절된다. 세포 성장의 인성 규정은 그 연구에 대한 시스템 레벨 접근을 필요로한다. 그러나, 조절 된 세포 성장의 엄격한 실험적 연구는 세포가 성장하는 속도를 제어하는 어려움에 의해 도전된다. 또한, 가장 간단한 실험에서 세포 외 조건은 그들이 증식과 세포가 지속적으로 환경을 변경 자주 역동적이고 복잡하다. 정의 불변 및 제어 환경에서 세포 성장률 실험 제어를 가능하게 세포를 배양하는 방법에있어서, 이러한 문제에 대한 해결책은 chemostat에 의해 제공된다.
chemostat를 사용하여 연속 배양하는 방법은 독립적으로 1950 년에 모 노드 3 노빅 & Szilard 4에 의해 설명되었다. 원래 생각으로, 세포는 사기꾼 미디어의 고정 된 볼륨에서 재배되는tinually 새로운 미디어 및 기존 미디어와 세포의 동시 제거 (그림 1)을 첨가하여 희석. 결합 상미 분 방정식 (도 2) 세포 밀도 (x)와 chemostat 용기에서 성장 제한 영양소 (들)의 농도의 변화율을 설명한다. 중요한 사실은, 방정식이 시스템은 정상 상태에서, 세포 (즉, 지수 적 성장 속도 상수)의 비 성장 속도가 속도와 동일하다는 현저한 함축적으로 단일 (아닌) 안정 안정 상태 (도 3) 예측 하는 문화는 (D) 희석된다. 희석 비율을 변화시킴으로써 그것은 다른 성장 속도와 영양소 제한의 상이한 조건 하에서 세포의 정상 상태의 개체군을 확립 할 수있다.
chemostats을 사용하여 성장 속도의 제어 실험에서는 세포의 생리 변화에 대한 이해의 발전에 중요했다성장 5,6의 속도로. 그러나, 미생물 학적 방법이 이전의 의지는 20 세기 후반 동안 분자 생물학 연구에 폭발하는 동안 점점 더 모호하게되었다. 오늘, 미생물과 다세포 생물 및 시스템 수준의 분석을위한 게놈 스케일 방법의 출현으로 모두 성장 제어에 대한 새로운 관심은 chemostats의 사용에 대한 의욕을 갱신했다. 여기, 우리는 세포의 성장 속도의 정확한 제어 및 chemostats를 사용하여 유일하게 할 수있는 외부 환경에 투자 세 가지 응용 프로그램을 설명합니다. 성적 증명서 및 대사 산물로 – – 배위 성장률 규제 첫째, 우리는 생체 분자의 수천의 풍요 로움이 방법을 조사하기 위해 chemostats의 사용을 설명합니다. 둘째, 우리는 chemostats 경쟁 실험을 사용하여 영양이 제한 환경에서 서로 다른 유전자형 사이의 성장 속도의 차이의 정확한 추정치를 얻기 위해 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 셋째, 우리가 설명하는 방법 chemostats 수일정한 영양이 부족한 환경에서 성장하는 세포의 적응 진화를 연구하는 데 사용할 수. 이러한 예는 chemostats 환경의 상호 작용 및 적응 진화하여 세포 성장 조절 유전자의 시스템 수준의 조사를 가능하게되는 방법을 예시.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chemostats 성장 제어 정상 상태 조건에서 미생물의 배양을 가능하게한다. 세포는 고정 외부 환경의 결과로 일정한 속도로 연속적으로 성장한다. 이것은 외부 환경이 지속적으로 변화하고 세포 성장의 레이트가 환경이나 유전자형의 복잡한 상호 작용에 의해 결정되는 회분식 배양 방법과 대조적이다. 따라서, 배치 배양 위에 chemostats에서 미생물을 배양의 주요 장점은 실험적으로 세포의 성장 속도?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 자금이 뉴욕 대학을 형성하기 시작에 의해 지원되었다. 우리는 처음에 chemostats로 Sixfors 생물 반응기의 사용을 개발 미륵 던햄와 매트 브라우어 감사합니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Infors-HT Sixfors Chemostat | Appropriate Technical Resources, Inc. | ||
| Glass Bottle 9.5 L | Fisher Scientific | 02-887-1 | For Media Vessel and Hosing |
| Pinchcock | Fisher Scientific | 05-867 | For Media Vessel and Hosing |
| Stopper, Size 12, Green Neoprene | Cole-Palmer | EW-62991-42 | For Media Vessel and Hosing |
| Straight Connector | Cole-Palmer | EW-30703-02 | For Media Vessel and Hosing |
| General purpose ties 4 in | Fisher Scientific | NC9557052 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone Rubber | Small Parts | B000FMWTDE | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 3/8 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1Q | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 7/32 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1E | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD | McMaster-Carr | 6100K164 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD | McMaster-Carr | 6100K161 | For Media Vessel and Hosing |
| Hook Connectors | Fisher Scientific | 14-66-18Q | For Media Vessel and Hosing |
| Ratchet Clamp | Cole-Palmer | EW-06403-11 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Female | Cole-Palmer | EW-45512-34 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Male | Cole-Palmer | EW-45513-04 | For Media Vessel and Hosing |
| Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm | Fisher Scientific | MTGR05010 | For Media Vessel and Hosing |
| PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm | Fisher Scientific | NC9131037 | For Media Vessel and Hosing |
| Direct-Reading Flowtube for Air | Cole-Palmer | EW-32047-77 | For Nitrogen Gas Setup |
| Direct-Reading Flowtube for Nitrogen | Cole-Palmer | EW-32048-63 | For Nitrogen Gas Setup |
| Gas Proportioner Multitube Frames | Cole-Palmer | EW-03218-50 | For Nitrogen Gas Setup |
| Regulator, Two-Stage Analytical | Airgas | Y12-N145D580 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Adaptor, Stainless Steel | Airgas | Y99-26450 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Male Adaptor | Airgas | WES544 | For Nitrogen Gas Setup |
| Norprene Tubing | US Plastics | 57280 | For Nitrogen Gas Setup |
| Tripod Base | Cole-Palmer | EW-03218-58 | For Nitrogen Gas Setup |
| Valve Cartridges | Cole-Palmer | EW-03217-92 | For Nitrogen Gas Setup |
| Carboy 10 L | Fisher Scientific | 02-963-2A | For Media Preperation |
| Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size | Fisher Scientific | SCGP-T10-RE | For Media Preperation |
| Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size | Fisher Scientific | FB-800-100 | For Media Preperation |
| calcium chloride·2H2O | Fisher Scientific | C79-500 | Media Reagents |
| sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | Media Reagents |
| magnesium sulfate·7H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | AC424205000 | Media Reagents |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | AC423400010 | Media Reagents |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | Media Reagents |
| boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Media Reagents |
| copper sulfate·5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Media Reagents |
| potassium iodide | Sigma Aldrich | 60400 | Media Reagents |
| ferric chloride·6H2O | Fisher Scientific | I88-100 | Media Reagents |
| manganese sulfate·H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| sodium molybdate·2H2O | Sigma Aldrich | M7634 | Media Reagents |
| zinc sulfate·7H2O | Fisher Scientific | Z68-500 | Media Reagents |
| biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | Media Reagents |
| calcium pantothenate | Fisher Scientific | AC24330-1000 | Media Reagents |
| folic acid | Sigma Aldrich | F7876 | Media Reagents |
| inositol (aka myo-inositol) | Fisher Scientific | AC12226-1000 | Media Reagents |
| niacin (aka nicotinic acid) | Sigma Aldrich | N4126 | Media Reagents |
| p-aminobenzoic acid | Fisher Scientific | AC14621-2500 | Media Reagents |
| pyridoxine HCl | Sigma Aldrich | P9755 | Media Reagents |
| riboflavin | Sigma Aldrich | R4500-25G | Media Reagents |
| thiamine HCl | Fisher Scientific | BP892-100 | Media Reagents |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000-100G | Media Reagents |
| Uracil | Sigma Aldrich | U0750 | Media Reagents |
| Dextrose | Fisher Scientific | DF0155-08-5 | Media Reagents |
Referencias
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