Chromosoom Voorbereiding Van gekweekte cellen

Summary

Chromosomen kunnen worden geïsoleerd uit levende cellen zoals lymfocyten of huidfibroblasten en organismen, met inbegrip van mensen of muizen. Deze chromosoom preparaten kunnen verder worden gebruikt voor routinematige G-banding en moleculaire cytogenetische procedures zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), vergelijkende genomische hybridisatie (CGH) en spectrale karyotypering (SKY).

Abstract

Chromosoom (cytogenetische) analyse wordt veel gebruikt voor de detectie van chromosomale instabiliteit. Als gevolgd door G-banding en moleculaire technieken zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), deze test is de krachtige mogelijkheid om individuele cellen te analyseren voor aberraties die winsten of verliezen van delen van het genoom en herschikkingen waarbij een of meer chromosomen betreffen. Bij de mens, chromosoomafwijkingen treden bij ongeveer 1 per 160 levendgeborenen ^1,2, 60-80% van alle miskramen ^3,4, 10% van de doodgeborenen ^2,5, 13% van de personen met een aangeboren hartaandoening ^6, 3-6% van onvruchtbaarheid gevallen ^2, en bij veel patiënten met vertraging in de ontwikkeling en geboorteafwijkingen ^7. Cytogenetische analyse van maligniteit routinematig gebruikt door onderzoekers en clinici, zoals observaties van klonale chromosomale afwijkingen is aangetoond dat zowel diagnostische en prognostische betekenis ^8,9 hebben.60; Chromosoom isolatie is van onschatbare waarde voor gentherapie en stamcelonderzoek van organismen, waaronder niet-humane primaten en knaagdieren ^10-13.

Chromosomen kunnen worden geïsoleerd uit cellen van levende weefsels, zoals bloed lymfocyten, huidfibroblasten, amniocyten, placenta, beenmerg en tumormonsters. Chromosomen worden geanalyseerd op het metafase van de mitose, wanneer ze het meest gecondenseerd en daardoor beter zichtbaar. De eerste stap van het chromosoom isolatietechniek omvat de verstoring van de spindel vezels door incubatie met Colcemid, te voorkomen dat de cellen te gaan tot de volgende anafase stadium. De cellen worden vervolgens behandeld met een hypotone oplossing en bewaard in de gezwollen toestand met Carnoy fixeermiddel. De cellen worden vervolgens gedropt op slides en kan dan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan procedures. G-banding gaat trypsine behandeling, gevolgd door kleuring met Giemsa om karakteristieke lichte en donkere banden te creëren. Dezelfde procedure chromosomen isoleren kan worden gebruikt voor de bereiding van cellen voor procedures zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), vergelijkende genomische hybridisatie (CGH) en spectrale karyotypering (SKY) ^14,15.

Introduction

Chromosoom analyse is een conventionele techniek wereldwijd gebruikt om chromosomale instabiliteit en herschikkingen leiden tot genetische aandoeningen en maligniteit ^1,2,8,9 diagnosticeren. Bovendien kan een hogere resolutie voor de diagnose en het onderzoek van constitutionele en kanker verworven genetische afwijkingen worden bereikt met de combinatie van de klassieke cytogenetische procedures en moleculaire cytogenetische methodes zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), vergelijkende genomische hybridisatie (CGH) , en spectrale karyotypering (SKY) ^14,15. Recenter zijn deze technieken zijn gebruikt voor het evalueren van chromosomale instabiliteit geassocieerd met stamcellen. Karyotypic afwijkingen zoals aneuploïdie langdurig gekweekte embryonale cellen (ES) en volwassen stamcellen van verschillende organismen zijn gerapporteerd door verschillende laboratoria. Recent bewijs ondersteunt dat sommige cellijnen zijn inherent meer geneigd om chromosoom instabiliteit ongeacht kweekomstandigheden. Om deze reden, bij het opzetten en / of onderhouden van mens, muis, of Rhesus stamcellijnen, wordt chromosoomanalyse aanbevolen als onderdeel van de kwaliteitscontrole. Veel rapporten beschrijven de toenemende belangstelling voor het gebruik van routine en moleculaire cytogenetica de chromosomale stabiliteit van stamcellen en kwaadaardige cellen of verschillende organismen in cultuur ^10-13 volgen. Deze protocollen worden steeds vaker gebruikt door niet-genetische laboratoria voor snelle chromosomale beoordeling van hun gekweekte cellen ^13. We presenteren onze basisprocedures voor chromosoom bereiding van verschillende celtypes, die kan worden toegepast zowel klinisch als onderzoeksdoeleinden en cellen afkomstig van verschillende organismen.

Protocol

1. Chromosoom oogsten van hechtende cellen Standaard Protocol Kweek cellen volgens bepaalde cel kweekomstandigheden. Wanneer de cellen logaritmische fase (80% confluentie) bereikt, voeg 10 ul / ml Colcemid de celkweek kolf. Een minimum van 2 x 10 6 cellen wordt aanbevolen. Incubeer cellen bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator gedurende 45 minuten. Met behulp van een steriele pipet media uit cellen in een 15 ml conische buis. Zet opzij. Voorzich…

Representative Results

Hoge kwaliteit metafase spreads zijn essentieel voor chromosoomonderzoek. Een succesvolle test levert chromosomen die goed verspreid en van geschikte chromosoom morfologie. Goed G-gestreepte chromosomen bevatten de karakteristieke lichte en donkere strepen patronen. Figuur 1. Een succesvolle chromoso…

Discussion

Wij hebben de onderhavige procedure chromosoom isolatie van cellen van diverse organismen, waaronder verschillende soorten cellen verkregen uit menselijke, Rhesus makaken, ratten en muizen ^11,20-22 gebruikt. Het standaardprotocol is voorzien, maar een aantal belangrijke stappen en variabelen moeten worden aangepast voor deze verschillende soorten cellen. Een aantal specifieke stappen zijn cruciaal in zowel de chromosomale voorbereiding en G-banding om de best mogelijke kwaliteit van de resultaten te garandere…

Materials

KaryoMAX Colcemid	Gibco	15212-012
HBSS Buffer	Gibco	24020-117
0.5% Trypsin EDTA 10x	Gibco	15400-054
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Buffer Tablets "GURR"	Gibco	10580-013
Geimsa Stain	Ricca Chemical Company	3250-16
Centrifuge 5810	Eppendorf
Methanol	Caledon Laboratory Chemicals	6700130
Glacial Acetic Acid	Krackeler Scientific Inc.	11-9508-05