Kültür Hücrelerinin itibaren Kromozom Hazırlık
Summary
Kromozomlar gibi lenfositler ya da deri fibroblast gibi canlı hücrelerden izole edilir ve insan ya da fare gibi organizmalardan elde edilebilir. Bu kromozom preparatları ayrıca rutin G-bantlama ve bu in situ hibridizasyon (FISH) floresan, karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH), ve spektral karyotip (SKY) gibi moleküler sitogenetik işlemler için kullanılabilir.
Abstract
Kromozom (sitogenetik) analizi yaygın kromozom istikrarsızlık tespiti için kullanılır. G-bantlama ve bu in situ hibridizasyon (FISH) floresan gibi moleküler teknikler ile, ardından, bu deney, bir veya daha fazla kromozom içeren genom ve yeniden düzenleme bölümlerinin kar ya da zarar içeren sapmalarını için tek tek hücrelerin analiz etmek için güçlü bir yeteneği vardır. İnsanlarda, kromozom anormallikleri yaklaşık 1 160 canlı doğumda 1,2, tüm düşüklerin% 60-80 meydana 3,4, ölü doğumların% 10 2,5, konjenital kalp hastalığı 6,% 3-6 olan bireylerin% 13 infertilite vakalarının 2, ve gelişimsel gecikme ve doğum kusurları 7 ile birçok hastada. Klonal kromozomal anomalilerin gözlemler hem tanısal ve prognostik önemi 8,9 olduğu gösterilmiştir gibi habis sitogenetik analizi rutin olarak, araştırmacılar ve klinisyenler tarafından kullanılmaktadır.60; Kromozom izolasyon gen tedavisi için çok değerli olduğunu ve insan olmayan primatlarda ve kemirgenler 10-13 gibi organizmaların kök hücre araştırmaları.
Kromozomlar kan lenfositlerinin, deri fibroblastları, Amniyon sıvısı, plasenta, kemik iliği ve tümör örneklerinde de dahil olmak üzere, canlı dokular, hücreler izole edilebilir. En çok yoğunlaşmış ve bu nedenle daha net görünür olduğunda Kromozomlar, mitoz metafaz aşamasında analiz edilir. Kromozom izolasyon tekniği ilk adımı anafaz sonraki aşamaya geçmeden gelen hücreleri önlemek için Colcemid ile inkübasyon yoluyla iğ liflerin bozulmasını içerir. Hücreler daha sonra, hipotonik bir solüsyon ile muamele edildi ve Carnoy sabitleyici ile şişmiş bir halde muhafaza edilmektedir. Hücreler daha sonra slaytlar üzerine bırakılır ve daha sonra çeşitli prosedürler için kullanılabilir. G-bantlama karakteristik açık ve koyu renkli bantlar oluşturmak için Giemsa ile boyanarak, ardından tripsin muamele edilmesini içerir. Aynı prkromozom izole etmek ocedure örneğin in situ hibridizasyon (FISH) floresan, karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) ve spektral karyotipleme (gökyüzü) 14,15 gibi işlemler için hücrelerin hazırlanması için kullanılabilir.
Introduction
Kromozom analizi kromozom istikrarsızlığı ve genetik bozukluklar ve malignite 1,2,8,9 giden düzenlenmeleri teşhis etmek için dünya çapında kullanılan geleneksel bir tekniktir. Ayrıca, yapısal ve kanser kaynaklı genetik anormalliklerin teşhis ve araştırma için daha yüksek bir çözünürlük gibi floresan in situ hibridizasyon (FISH) sitogenetik olarak klasik prosedürler ve moleküler sitogenetik metodolojileri kombinasyonu, karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) ile elde edilebilir ve spektral karyotip (SKY) 14,15. Daha yakın zamanda, bu teknikler, kök hücre araştırma ile ilgili kromozom istikrarsızlık değerlendirilmesi için kullanılmıştır. Bu tür uzun süreli kültür embriyonik hücreler (ES) ve çeşitli organizmaların erişkin kök hücrelerinin anöploidinin olarak kromozomlarda anormallikler birden laboratuarlar tarafından bildirilmiştir. Yeni kanıtlar, bazı hücre hatları doğal kromozom instabilitenin birlik daha eğilimli olduğunu desteklerne olursa olsun kültür koşulları bağdaştırılır. Kurulması ve / veya insan, fare veya Rhesus kök hücre hatları muhafaza, bu nedenle, kromozom analizi, kalite kontrol işleminin bir parçası olarak tavsiye edilir. Birçok rapor, kültür 10-13 kök hücreleri ve habis hücrelerinin veya çeşitli organizmaların kromozomal stabilitesini izlemek için rutin ve moleküler sitogenetik kullanımında artan bir ilgi açıklar. Bu protokoller giderek onların kültürlü hücrelerin 13 hızlı kromozomal değerlendirilmesi için nongenetik laboratuvarlar tarafından kullanılmaktadır. Çeşitli organizmalardan elde edilen klinik ve araştırma amaçlı ve hücreler hem de uygulanabilir çeşitli hücre tipleri, kromozom hazırlanmasına yönelik temel prosedürleri sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çeşitli insan elde edilen hücre tipleri, Rhesus macaque maymunlarının, sıçanlar ve fareler dahil olmak üzere çeşitli 11,20-22 organizmaların hücrelerinden kromozom izolasyonu için, bu prosedür kullanılmıştır var. Standart protokol sağlanır, ancak bazı önemli adımlar ve değişkenler, bu çeşitli hücre türleri için ayarlanması gerekebilir. Birkaç belirli adımlar kromozomal hazırlanması ve sonuçların olası en iyi kaliteyi sağlamak için G-bantlama hem de çok önemlidir. Tahl…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yazıda anlatılan çalışma Patrick F. Taylor Vakfı fon ile mümkün olmuştur.
Materials
| KaryoMAX Colcemid | Gibco | 15212-012 | |
| HBSS Buffer | Gibco | 24020-117 | |
| 0.5% Trypsin EDTA 10x | Gibco | 15400-054 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Buffer Tablets "GURR" | Gibco | 10580-013 | |
| Geimsa Stain | Ricca Chemical Company | 3250-16 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | ||
| Methanol | Caledon Laboratory Chemicals | 6700130 | |
| Glacial Acetic Acid | Krackeler Scientific Inc. | 11-9508-05 |
Referencias
- Driscoll, D., Gross, S. Prenatal screening for aneuploidy. New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).
- Nussbuam, R., et al. . Genetics in Medicine: 7th Edition. , 76 (2007).
- Ljunger, E., et al. Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84 (11), 1103-1107 (2005).
- Kwinecka-Dmitri, B., et al. Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions. Ginecol. Pol. 81 (12), 896-901 (2010).
- Reddy, U., et al. Stillbirth classification—Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop. Obstet. Gynecol. 114 (4), 901-914 (2009).
- Pierpoint, M., et al. Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge. Circulation. 115 (23), 3015 (2007).
- Kaneshiro, N., Zieve, D. Down Syndrome: Trisomy 21.. PubMed Health. , (2010).
- Cin, P. D. . Current Protocols in Human Genetics. , (2003).
- Wang, N. Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics. Am. J. Med. Genet. 115 (3), 118-124 (2002).
- Miura, M., et al. Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation. Stem Cells. 24 (4), 1095-1103 (2006).
- Izadpanah, R., et al. Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells. Cancer Res. 68 (11), 4229-4238 (2008).
- Dekel-Naftali, M., et al. Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q. Eur. J. Hum. Genet. 20 (12), 1248-1255 (2012).
- Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells. Stem Cell Rev. Rep. 7 (2), 471-477 (2011).
- Bayani, J., Squire, J. Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis. Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).
- Speicher, M. R., Carter, N. P. The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. Nat. Rev. Genet. 6 (10), 782-792 (2005).
- Benn, P., Delach, J. Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. . Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. , (2011).
- Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. . The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition. , (1997).
- Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J., McClatchey, K. D. Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders. In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. , 658-685 (2002).
- Kibe, R., et al. IL-7Rα deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis. Cell Death Different. 19 (7), 1139-1151 (2012).
- Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22–>qter due to paternal Y; 16 translocation. Clin. Dysmorphol. 4 (4), 177-181 (2005).
- Tsien, F., et al. Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements. Cytogenet. Genome Res. 8 (1), 13-21 (2002).
- McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia. J. Clin. Pathol. 61 (8), 903-908 (2008).
