주변 줄기 세포 이주의 분석을위한 마우스 Cremaster 근육에있는 미세 혈관의의 intravital 현미경
Summary
마우스 M.의 cremaster 미소 순환의 intravital 현미경은 독특하고 주변 골수 줄기 세포 이동의 분석을위한 생체 모델에서 잘 표준화을 제공합니다.
Abstract
회생 세포 치료의 맥락에서 혈관 세포 애플리케이션 프로토콜의 시대에서, 조직 nonmarrow 줄기 세포 이동의 기본 메커니즘은 완전히 명확하지 않았다. 우리는 여기에서 생체 내에서 주변의 골수 줄기 세포 이동의 분석을 위해 마우스 cremaster의 미세 혈관에 적용의 intravital 현미경의 기술을 설명합니다. M.의 cremaster의 현미경의 intravital 이전 혈관 내피 세포와 백혈구 작용의 직접적인 관찰에 염증 연구 분야에 도입되었다. 충분한 주변 줄기 및 전구 세포의 이동은 내피와 intravasculary 관리 줄기 세포의 상호 작용의 관찰과 정량 M.의 cremaster 모델을 적용하기 위해 생각할 수있다 안감 내피에 따라 확고한 접착 롤링 유사한 초기 단계를 포함하기 때문에. 각종 화학 성분을 선택적으로 표적 t에 적용될 수있는 바와 같이superfusion 간단한 기술에 의해 문제는 그것이 골수 변두리 살아있는 유기체에서 일어나는 초기 줄기 세포 모집위한 필수적인 전제 조건의 미세 환경을 확립하는 것이 가능하다.
Introduction
본 문서의 목적은 주변의 골수 줄기 세포 이동의 직접 관찰 및 분석을위한 마우스 cremaster의 미세 혈관에 적용의 intravital 현미경의 기술 (IVM)를 설명하는 것입니다.
줄기 세포의 현재 개념 기반의 조직 및 장기 재생은 손상된 조직 1 골수 유래 줄기 세포의 원점을 포함한다. 성공적인 줄기 세포의 이동을위한 중요한 단계는 내피 마이그레이션 결국 장기 생착 2 다음에 부상 기관 내에서 지방의 내피 세포와 세포의 상호 작용을 줄기가 포함되어 있습니다. 이러한 줄기 세포의 intravital 분석 – 내피 세포 상호 작용은 생체 내에서 서로 다른 병태 생리 학적 설정에서 줄기 세포 기반 재생 반응의 정량화를위한 이상적인 매개 변수를 형성한다. 게다가 생각할 보인다, 미래에 특정 줄기 세포 (P)의 이동성 용량의 intravital 분석표준화 된 미세 순환 환경 내 opulations는 이전에 추가 임상 시험에이 인구를 전진 적용 할 수 있습니다.
의 intravital 현미경 초기 염증 연구 3의 분야에서 생체 내에서 백혈구 – 내피 세포 상호 작용의 관찰 및 정량화를 위해 개발되었다. 의 intravital 현미경 연구의 첫 번째 성공 기록은 광학 현미경 4에서 개구리 '방언과 mesenteries을 공부하고, 19 세기에 이미 Cohnheim에 의해보고되었다. 처음 사용 IVM은 엄청난 기술 개발과 오늘을받은 이후 특정 필수 구성 요소는 양적 IVM을 수행하기 위해 전제 조건을 형성 : (I) 조직 광 액세스를 허용 준비, (ⅱ) 현미경으로 검출 할 수있다 분자 프로브, (ⅲ ) 검출 시스템 및 화상 데이터로부터 그 파라미터를 추출 할 수있다 (iv) 컴퓨터 기반 분석 시스템에 연결된 현미경4를 설정합니다.
조직 준비의 다양한 mesenteries 및 마우스와 쥐 5, 마우스, 6, 햄스터, 토끼 귀 및 이름에 햄스터 뺨 주머니의 등쪽 피하 지방 챔버의 간을 포함 IVM의 연구에 도입되었습니다.
그러나, 준비 및 시각화가 잘 표준화 된 수술로 가능으로 다음에 우리의 intravital 관찰을위한 이상적인 조직을 나타내는 마우스 cremaster 근육에 초점을 맞출 것이다, 그리고 일반적으로 운동의 유물 아무런 문제가 발생하지 않습니다. 오픈 cremaster 근육 준비는 바에즈에 의해 1970 년대에 처음 실시와 동료 7되었다. 원래 쥐에 대해 기재된, 그것은 마우스 (8)에 성공적으로 채택되었다. 이전의 연구는 주로 혈관 벽 백혈구의 상호 작용에 초점을 맞추고 난 후에, 우리 자신의 그룹은 최근에를 증명하는 등의 마우스 cremaster 근육 준비를 도입직접 시각화 및 정의 미세 구 내에서 줄기 세포 – 내피 세포 상호 작용의 정량적 분석을위한 상상력 도구입니다. 각종 줄기 세포 모집단은 뮤린 C-KIT + 골수 줄기 세포 및 중간 엽 줄기 세포뿐만 아니라 인간의 CD (133) + 골수 줄기 세포 10-12 등이 모델을 이용하여 연구되었다. 기증자의 골수 및 시각화를위한 형광 표지로부터 세포 격리 다음, 줄기 세포를 선택적으로함으로써 원격 장기 내의 세포 포획을 회피 대퇴 동맥을 통해 동맥 주입을 이용하는 cremaster 미세 혈관에 적용된다. 잠재적으로 각각 설정 내의 로컬 줄기 세포의 이동을 매개 각종 케모카인이 국소 superfusion 간단한 기술에 의해 표적 조직에 적용 할 수 있기 때문에 한층 cremaster 근육 모델은 특히 유용하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
의 intravital 형광 현미경 직접 시각화 및 줄기 세포 내피 세포 상호 작용의 정량 분석을 할 수 있습니다. 노광 및 미세 수술 기술의 intravital 시각화가 잘 백혈구 – 내피 세포 상호 작용 및 다양한 화학 성분에 대한 연구 중에 선택적 superfusion 간단한 기술에 의해 표적 조직에 적용 할 수있는 확립 된 이후 cremaster 근육 모델은 특히 유용하다. 인해 움직임 아티팩트 심한 화상 노이즈의 부재로,?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA) | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | C1157 |
| Rhodamine 6 G (1%) | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 83697 |
| Ketamin (Ketanest) | Pfizer, Berlin, Germany | not available |
| Xylacin (Rompun) | Bayer, Leverkusen, Germany | not available |
| Dulbecco's Phosphate – buffered saline (PBS) | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P04-36500 |
Referencias
- Madlambayan, G. J., et al. marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger. Blood. 114, 4310-4319 (2009).
- Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. How do stem cells find their way home?. Blood. 106, 1901-1910 (2005).
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).
- Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo. Lab Invest. 74, 634-643 (1996).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. J. Vis. Exp. , e2874 (2011).
- Kaminski, A., et al. Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells. Lab Invest. 88, 58-69 (2008).
- Furlani, D., et al. HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells. J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).
- Furlani, D., et al. Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy. Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).
- Donndorf, P., et al. Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation. Cell Transplant. , (2012).
