Microscopia intravital de la microcirculación en el músculo de ratón Cremaster para el análisis de la migración de la célula madre periféricas
Summary
Microscopía intravital del cremáster microcirculación ratón M. ofrece un único y bien estandarizada-modelo in vivo para el análisis de médula ósea periférica migración de células madre en.
Abstract
En la era de los protocolos de aplicación de células intravasculares en el contexto de la terapia celular regenerativa, los mecanismos subyacentes de la migración de células madre de tejido nonmarrow no han sido completamente aclarados. Se describe aquí la técnica de microscopía intravital aplicado a la microcirculación cremáster ratón para el análisis de médula ósea periférica migración de células madre in vivo. Microscopía intravital de la M. cremáster se ha introducido previamente en el campo de la investigación inflamatoria para la observación directa de la interacción de leucocitos con el endotelio vascular. Desde madre periféricas suficiente y la migración de células progenitoras incluye los pasos iniciales similares de rodar a lo largo de y la adhesión firme en el revestimiento endotelial es concebible aplicar el modelo M. cremáster para la observación y cuantificación de la interacción de las células madre administrados intravasculary con el endotelio. Como diversos componentes químicos pueden ser aplicados selectivamente a la diana Tproblema mediante técnicas de superfusión simples, es posible establecer condiciones previas esenciales microambientales, para el reclutamiento de células madre inicial que tendrá lugar en un organismo que vive fuera de la médula ósea.
Introduction
El propósito del presente artículo es describir la técnica de microscopía intravital (IVM) aplicado sobre la microcirculación cremáster ratón para la observación directa y el análisis de médula ósea periférica migración de células madre.
La regeneración de tejidos y de órganos El concepto actual de células madre basado implica el homing de las células madre derivadas de la médula ósea al tejido lesionado 1. Un paso crucial para el éxito de la migración de células madre incluye la interacción de células madre con el endotelio local dentro del órgano lesionado, seguido de la migración transendotelial y, finalmente, el injerto de órganos 2. Análisis intravital de estas células madre – interacciones de células endoteliales se forma un parámetro ideal para la cuantificación de una respuesta regenerativa de células madre basada en diferentes contextos fisiopatológicos in vivo. Además, parece concebible, que, en el futuro, el análisis intravital de la capacidad migratoria de p específico de células madreopulations dentro de los entornos de la microcirculación estandarizadas, podrían aplicarse antes de avanzar en estas poblaciones de más pruebas clínicas.
Microscopía intravital se ha desarrollado inicialmente para la observación y cuantificación de la interacción célula-endotelial de leucocitos in vivo en el campo de la investigación inflamatoria 3. Primeras grabaciones exitosas de estudios de microscopía intravital fueron reportados por Cohnheim ya en el siglo 19, el estudio de las lenguas y entresijos de rana con un microscopio de luz 4. Desde su primer uso IVM ha experimentado un enorme desarrollo técnico y en la actualidad ciertos componentes esenciales formen requisitos previos para llevar a cabo IVM cuantitativa: (i) preparaciones de tejidos que permiten el acceso óptico, (ii) sondas moleculares que pueden ser detectadas por un microscopio, (iii ) un microscopio conectado a un sistema de detección y (iv) los sistemas de análisis basados en ordenador que puede extraer parámetros de interés a partir de los datos de imagenestablecer 4.
Una variedad de preparaciones de tejidos se ha introducido para los estudios de MIV incluyendo los entresijos y el hígado del ratón y de rata 5, las cámaras de los pliegues cutáneos dorsal de ratón 6 y el hámster, la oreja del conejo y de la bolsa de la mejilla del hámster por nombrar algunos.
Sin embargo, en lo que sigue nos centraremos en el músculo cremáster ratón, lo que representa un tejido ideal para las observaciones intravitales, como la preparación y la visualización son posibles mediante un procedimiento quirúrgico bien estandarizados, y en general no se producen problemas de artefactos de movimiento. La preparación del músculo cremáster abierto se llevó a cabo por primera vez en la década de 1970 por Báez y sus colegas 7. Originalmente descrito para ratas, se ha adoptado con éxito también para el ratón 8. Después de los estudios anteriores se habían centrado principalmente en la interacción de leucocitos con la pared del vaso, nuestro grupo ha presentado recientemente la preparación Cremáster ratón como valoraciónble herramienta para la visualización directa y el análisis cuantitativo de la madre de las interacciones célula-endotelio dentro de un microambiente definido 9. Varios subpoblaciones de células madre se han estudiado utilizando este modelo, incluyendo las células madre mesenquimales de c-kit murino + de células madre de médula ósea y, así como de CD humano células madre de la médula ósea 133 + 10-12. Tras el aislamiento de células de donante de médula ósea y etiquetado fluorescente para la visualización, las células madre se aplican selectivamente en la microcirculación cremáster la utilización de una inyección arterial a través de la arteria femoral, evitando de este modo cualquier atrapamiento de células dentro de los órganos remotos. Además, el modelo de músculo cremáster es particularmente útil, ya que diversas quimiocinas potencialmente que median la migración de células madre local dentro de los ajustes respectivos, se pueden aplicar tópicamente al tejido diana mediante la técnica de superfusión sencilla.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microscopía de fluorescencia intravital permite la visualización directa y el análisis cuantitativo de la madre de las interacciones célula-endotelio. El modelo de músculo cremáster es particularmente útil, ya que la exposición de microcirugía y técnicas de visualización intravital han sido bien establecido durante la investigación sobre las interacciones entre leucocitos y endotelio diversos componentes químicos se puede aplicar selectivamente al tejido diana mediante la técnica de superfusión senc…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA) | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | C1157 |
| Rhodamine 6 G (1%) | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 83697 |
| Ketamin (Ketanest) | Pfizer, Berlin, Germany | not available |
| Xylacin (Rompun) | Bayer, Leverkusen, Germany | not available |
| Dulbecco's Phosphate – buffered saline (PBS) | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P04-36500 |
Referencias
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