モーター神経切断とライブゼブラフィッシュにおけるグリア細胞の挙動のタイムラプスイメージング
Summary
末梢神経系（PNS）は、損傷後の大幅な修理が可能ですが、少しは、この現象を支配する細胞および分子メカニズムについてはほとんど知られていない。ライブ、トランスジェニックゼブラフィッシュと再現神経切断アッセイを使用して、我々は、神経変性と再生の間ダイナミックグリア細胞の挙動を学ぶことができます。
Abstract
神経系は、しばしば、それが信じられないほどの柔軟性と可塑性を維持しつつ、一貫した、ステレオタイプの方法で外部刺激に反応する流体かなり臓器系であっても、本体のハードワイヤード成分として記載されている。中枢神経系とは違って（CNS）、末梢神経系（PNS）が重要な修理が可能ですが、私たちはようやく、この現象を支配する細胞および分子メカニズムを理解し始めている。モデル系としてゼブラフィッシュを用いて、in vivoイメージングと遺伝子操作でと夫婦再生の研究に前例のない機会を持っている。末梢神経膠細胞とは結合組織の層に囲まれた軸索で構成されている。軸索は神経周膜と呼ばれる細胞のシースによって束に包まれた順番にあるシュワン細胞、髄鞘形成または非ミエリンによってensheathedされています。損傷後、成人末梢神経は、サンレモに顕著な能力を持っているVE軸索の破片や再支配目標を破損。 PNS再生における全ての周辺グリアの役割を調べるために、我々はここに住んでトランスジェニックゼブラフィッシュの運動神経をaxotomize市販の窒素励起色素レーザーを使用して軸索横断アッセイを説明します。私たちは、さらに負傷者や制御神経のタイムラプスイメージングに結合するように、これらの実験の方法を説明します。この実験的なパラダイムは、グリア細胞は神経再生で再生するだけでなく、神経系の修復を支配する分子メカニズムを解明するためのプラットフォームとなることができます。という役割を評価しないために使用することができます
Introduction
ゼブラフィッシュがあるため、その光学透明の神経系の発達を研究し、遺伝子導入のしやすさ、その結合されたときに、生きている胚の動的細胞挙動の壮大なイメージングを可能にするために広く使用されてきた。ゼブラフィッシュと哺乳類は、ほぼすべての神経系の形成、このモデル生物で収集細胞および分子情報に必要な遺伝子の共有しているため、さらに、他の脊椎動物種に直接話すことのできるある。神経発達研究のための信じられないほど強力なものの、ゼブラフィッシュとそのユニークな属性も損傷後の神経系を維持し、再構築のメカニズムを解明する可能性を秘めている。ゼブラフィッシュの幼虫は、後期幼生期に彼らの半透明性を維持し、色素沈着を効果的にメラニン生成や色素細胞を欠いている遺伝的変異体の薬理学的阻害剤の使用のいずれかをブロックすることができます。このように、けがやregeneratを勉強するために、このモデル生物を用いた高齢動物でイオンが可能であり、直接神経系を再構築する細胞および分子メカニズムを調査するためのユニークな機会を提供しています。本稿では、効率的かつ再現ゼブラフィッシュ幼生のPNSの神経を傷つける方法を説明します。この傷害パラダイムは退化しないだけの勉強に向いてだけでなく、周辺グリアと免疫細胞の応答と同様に、再生時のこれらの集団間の相互作用。
PNSは、生物がその環境と相互作用し、生き残るできるように、中枢神経系（CNS）および皮膚、臓器や身体の筋肉間で情報を渡す必要がある運動感覚神経の複雑なネットワークである。髄鞘形成と非ミエリンシュワン細胞と神経鞘グリアならびに結合組織、軸索包む、最終的に成熟した神経を形成するなど、これらの神経に沿って、周辺グリア、。これらの神経の損傷は、プロセスkを開始するウォーラー変性10としてノウン。軸索の断片化、免疫募集、破片クリアランスと再生のこのメカニズムは1非常に紋切り型と遺伝的に規制されています。哺乳動物系における以前の研究では、神経変性および再生1、2、6、8時のシュワン細胞の役割を記載している。固定組織または細胞培養のこれらの研究では、シュワン細胞だけでなく、デブリクリアランスを助けるために、損傷部位へのマクロファージを採用し、また、ミエリン貪食自体が支援。これらの研究は非常に有益であったが、我々はリアルタイムでin vivoでの末梢軸索損傷に可視化グリア応答前に決して持っていないし、他の研究では、これらのイベントの間に周辺グリアの異なるクラス間の関係を調査していない。
最近では、いくつかのラボは、我々がここで説明するものと同様のゼブラフィッシュとレーザー媒介軸索損傷を使っウォーラー変性を検討してきた<sup> 4、5、7、9。これらの研究のいくつかでは、表面的な感覚の軸索は、カスタム構築された、二光子共焦点顕微鏡4、5、9を使用して、若い幼虫に軸索切断された。私たち自身に非常に類似している別の研究では、腹側運動神経軸索内のより深い、市販のレーザーアブレーションシステム7を使用して5日齢の幼虫に離断された。これらの実験のセットアップの両方では、焦点は、ウォーラー変性と軸索の両方と免疫細胞画像化した上にあった。これらの研究に展開するには、我々はより成熟した、有髄神経とアッセイ変性と再生中にすべての神経関連の周辺グリアの応答と古い幼虫、モータ軸索を負傷について説明します。
これを行うには、我々は（DPF）6と7日後の受精で運動神経を横断する幼虫と負傷軸索に沿ってこれらの集団の間の相互作用を調査するだけでなく、個々のグリア細胞集団の反応を可視化する。ダブル、トリプルTRAを使用そのシュワン細胞と神経鞘グリアならびに軸索のマーカーを含むラベル周辺グリア、nsgenicラインは、我々は成る市販のレーザーアブレーションシステム使用スピニングディスク共焦点システムに接続されている色素レーザーは、（波長435 nm）を窒素励起軸索transectionsを作成します。これは実験のセットアップ私たちはお互いに軸索損傷とそれらの関係を特定の末梢運動軸索路とタイムラプス画像異なるグリア集団の応答を傷つけ、ライブ、幼虫のゼブラフィッシュを視覚化することができます。このプロトコルは、さらに別の科学的な疑問を解決するために別のトランスジェニック系統や遺伝的変異と、異なる年齢のゼブラフィッシュの神経傷害を作成するために適応させることができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
この実験的なデザインの中で最も重要なステップは次のとおりである：1） 生体内イメージングと2 の怪我とその後のために適切に取り付け幼虫）クリーン神経切断を作成するために、レーザーを校正し、正しい電源設定を選択することを最小限の余分な組織の損傷につながる。 in vivoイメージングとその後の分析で成功するための軸索切断を確保するために、個々?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は見事な技術サポートのための貴重な議論とクォーラム·テクノロジーズ·インクのためKucenasラボに感謝したいと思います。仕事は、科学技術の卓越性のためのUVA基金（FEST）（SK）によってサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629-100G |
| Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222 | Argent Chemical | C-FINQ-UE-100G |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414-10G |
| Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One | VWR/Greiner | 89125-444 |
| Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick | Willco Wells | GWSt-3512 |
| MicroPoint Laser System with all components | Andor Technology – purchased through Quorum Technologies, Inc. | 2203-SYS |
| MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm) | Andor Technology | MP-27-435-DYE |
Referencias
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