Motor Nerve transecção e Time-lapso de Comportamentos de células gliais em Zebrafish ao vivo
Summary
Embora o sistema nervoso periférico (SNP) é capaz de reparação significativa após a lesão, pouco se sabe sobre os mecanismos celulares e moleculares que governam este fenómeno. Usando vivo, zebrafish transgênicos e um teste de secção do nervo reprodutível, podemos estudar os comportamentos de células gliais dinâmicas durante a degeneração do nervo e regeneração.
Abstract
O sistema nervoso é frequentemente descrito como um componente de hard-wired do corpo, mesmo que seja um sistema de órgãos consideravelmente fluido que reage a estímulos externos em uma maneira consistente estereotipado, mantendo ao mesmo tempo a flexibilidade e plasticidade incrível. Ao contrário do sistema nervoso central (SNC), o sistema nervoso periférico (SNP) é capaz de reparação significativa, mas apenas começaram a compreender os mecanismos celulares e moleculares que governam este fenómeno. Usando zebrafish como um sistema modelo, temos a oportunidade sem precedentes para estudos regenerativos casal com in vivo de imagens e manipulação genética. Os nervos periféricos são compostos de axónios rodeado por camadas de células gliais e de tecido conjuntivo. Axônios são ensheathed por myelinating ou não células mielinizantes de Schwann, as quais são, por sua vez envolvida num fascículo por uma bainha celular chamado o perineuro. Após uma lesão, nervos periféricos adultos têm a notável capacidade de remove danificado detritos axonal e alvos de re-inervam. Para investigar os papéis de todos os glia periférica na regeneração PNS, descrevemos aqui um ensaio transection axônio que usa um laser de corante disponível comercialmente nitrogênio bombeado para axotomize nervos motores em zebrafish transgênicos ao vivo. Descrevemos ainda mais os métodos para casal estas experiências à imagem time-lapse de nervos lesados e controle. Este paradigma experimental pode ser utilizado não só para avaliar o papel que desempenham na glia regeneração do nervo, mas pode também ser a plataforma para elucidar os mecanismos moleculares que governam a reparação do sistema nervoso.
Introduction
Zebrafish têm sido extensivamente usados para estudar o desenvolvimento do sistema nervoso devido a sua transparência óptica e facilidade de transgénese, que, quando acoplados, para permitir imagiologia espectacular dos comportamentos dinâmicos das células num embrião vivo. Além disso, por causa do peixe-zebra e mamíferos partes quase todos os genes necessários para a formação do sistema nervoso, a informação celular e molecular recolhidos neste modelo organismo é directamente relacionáveis com outras espécies de vertebrados. Embora extremamente poderosa para o estudo do desenvolvimento neural, o peixe-zebra e os seus atributos únicos têm o potencial de também explicar os mecanismos que mantêm e reconstruir o sistema nervoso após a lesão. Larvas de peixe-zebra manter a sua translucidez em estágios larvais tardias e pigmentação pode ser bloqueado, quer com a utilização de inibidores farmacológicos de produção de melanina ou de mutantes genéticos que carecem de células de pigmento. Assim, usando este organismo modelo para estudar lesões e se regeneraion em animais mais velhos é possível e oferece a oportunidade única de investigar diretamente os mecanismos celulares e moleculares que reconstruir o sistema nervoso. Neste artigo, descrevemos como a ferir de forma eficiente e reproduzível nervos nos PNS de larvas de peixe-zebra. Este paradigma lesão presta-se a estudar não só a degeneração, mas também as respostas das células gliais e células do sistema imunológico periférico, bem como as interacções entre estas populações durante a regeneração.
O SNP é uma rede complexa de nervos motores e sensoriais que é necessário para passar informação entre o sistema nervoso central (CNS) e na pele, músculo e órgãos do corpo, permitindo que um organismo de interagir com o seu ambiente e sobreviver. Ao longo destes nervos, células gliais periférico, incluindo células mielinizantes e não mielinizantes de Schwann e glia perineural, bem como o tecido conjuntivo, encerram os axónios e finalmente formam o nervo madura. Lesão destes nervos inicia um processo de known como degeneração Walleriana 10. Este mecanismo de fragmentação axonal, recrutamento imunológico, liberação de detritos e regeneração é muito estereotipada e geneticamente regulado 1. Estudos anteriores em sistemas de mamíferos têm descrito as funções das células de Schwann, durante a degeneração do nervo e regeneração 1, 2, 6, 8. Nestes estudos de tecido fixo ou de cultura de células, as células de Schwann, não só recrutados macrófagos para o local da lesão para ajudar na depuração de detritos, mas também ajudou na mielina fagocitose si. Embora esses estudos tenham sido incrivelmente informativo, nunca temos antes de respostas gliais visualizadas a lesão axonal periférica in vivo em tempo real, e não outros estudos investigaram a relação entre as diferentes classes de glia periférica durante esses eventos.
Recentemente, vários laboratórios têm investigado a degeneração Walleriana utilizando zebrafish e lesão axonal mediada por laser de semelhante ao que descrevemos aqui <sup> 4, 5, 7, 9. Em alguns desses estudos, os axônios sensoriais superficiais foram axotomizado em larvas jovens usando um costume construído, dois fótons microscópio confocal 4, 5, 9. Em outro estudo, que é muito semelhante à nossa, axônios mais profundas dentro do nervo motor ventral foram seccionados em cinco dias de idade larvas usando um sistema de ablação a laser disponível no mercado 7. Em ambos os experimentais set-ups, o foco foi a degeneração Walleriana e os axônios e células imunológicas foram fotografados. Para ampliar esses estudos, descrevemos ferindo axônios motores em larvas mais velhas, com mais maduras, nervos mielinizados e ensaio a resposta de todos glia nervo periférico associado durante a degeneração e regeneração.
Para fazer isso, nós transecto nervos motores de 6 e 7 dias após a fertilização (dpf) larvas e visualizar as respostas das populações da glia individuais, bem como investigar as interações entre essas populações ao longo dos axônios lesionados. Usando tra duplos e triploslinhas nsgenic que a glia periférica etiqueta, incluindo as células de Schwann e glia perineural, bem como um marcador de axónios, que utilizam um sistema de ablação a laser disponíveis no comércio consistindo de um átomo de azoto-de corante bombeado a laser (comprimento de onda de 435 nm) ligado a um sistema de disco giratório confocal para criar axônio transecções. Este experimental set-up permite visualizar ao vivo, peixe-zebra larval, ferir imagem time-lapse as respostas das populações da glia distintos tratos dos axônios motores periféricos específicos e à lesão axonal e sua relação com o outro. Este protocolo pode ainda ser adaptado para criar lesões nervosas em zebrafish de diferentes idades, com diferentes linhagens transgênicas ou mutantes genéticos para abordar diferentes questões científicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os passos mais críticos da presente delineamento experimental são os seguintes: 1) para a montagem propriamente larvas lesão e subsequente in vivo de imagens e 2) calibrar o laser e escolhendo os ajustes de potência correctos, a fim de criar um corte transversal do nervo limpa que resulta em danos mínimos dos tecidos extra- . Para ajudar a garantir uma axotomia sucesso para in vivo de imagens e posterior análise, montar larvas múltiplas tanto em pratos com fundo de vidro individuais ou em um pra…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao Laboratório Kucenas pelas valiosas discussões e Tecnologias de quorum, Inc. Para obter suporte técnico soberbo. O trabalho foi apoiado pelo Fundo UVA de Excelência em Ciência e Tecnologia (FEST) (SK).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629-100G |
| Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222 | Argent Chemical | C-FINQ-UE-100G |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414-10G |
| Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One | VWR/Greiner | 89125-444 |
| Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick | Willco Wells | GWSt-3512 |
| MicroPoint Laser System with all components | Andor Technology – purchased through Quorum Technologies, Inc. | 2203-SYS |
| MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm) | Andor Technology | MP-27-435-DYE |
Referencias
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