Separazione di tipi di cellule della spermatogenesi Usando STA-PUT velocità di sedimentazione
Summary
Il metodo STA-PUT consente la separazione delle diverse popolazioni di cellule spermatogenesi in base alle dimensioni e densità.
Abstract
Spermatogenesi mammifero è un processo di differenziazione complesso che avviene in più fasi nei tubuli seminiferi dei testicoli. Attualmente, non esiste un sistema di coltura cellulare affidabile consentendo differenziazione spermatogenesi in vitro, e la maggior parte degli studi biologici di cellule spermatogenesi richiedono raccolta dei tessuti da modelli animali come il topo e nel ratto. Poiché il testicolo contiene numerosi tipi di cellule – sia non spermatogenesi (Leydig, Sertoli, mieloidi e cellule epiteliali) e spermatogenesi (spermatogoni, spermatociti, spermatidi rotondi, a condensazione spermatidi e spermatozoi) – Studi dei meccanismi biologici coinvolti nella spermatogenesi richiedono l'isolamento e arricchimento di questi tipi di cellule differenti. Il metodo STA-PUT consente la separazione di una popolazione eterogenea di cellule – in questo caso, dai testicoli – attraverso un gradiente lineare BSA. Tipi di cellule individuali sedimentano con velocità di sedimentazione diversa a seconda cedimensioni ll, e le frazioni arricchito da diversi tipi di cellule possono essere raccolti e utilizzati in ulteriori analisi. Mentre il metodo STA-PUT non comporta frazioni altamente puri di tipi di cellule, ad esempio come possono essere ottenuti con determinati metodi di separazione delle cellule, esso fornisce un rendimento molto più elevato di cellule totali in ogni frazione
(~ 1 x 10 8 cellule / tipo di cellula spermatogenesi da una popolazione iniziale di 7-8 x 10 8 cellule). Questo metodo alto rendimento richiede solo vetreria specializzata e può essere eseguita in qualsiasi ambiente freddo o grande frigorifero, che lo rende un metodo ideale per i laboratori che hanno accesso limitato alle attrezzature specializzate come una fluorescenza attivato cell sorter (FACS) o elutriator.
Introduction
Spermatogenesi mammifero è un processo di differenziazione complesso che avviene in più fasi nei tubuli seminiferi dei testicoli 1. In breve, staminali come gli spermatogoni che risiedono vicino l'epitelio del tubulo seminifero divide e differenziarsi in spermatociti, che poi subiscono le divisioni meiotica. Dopo meiosi è completa, le cellule aploidi risultante o spermatidi rotondi, subiscono spermiogenesi, un processo di differenziazione che coinvolge lo spargimento del citoplasma e compattazione del nucleo. Spermatidi gradualmente sviluppano un flagello e subiscono l'allungamento e la condensazione del nucleo, producendo allungamento e poi a condensazione spermatidi, rispettivamente. I prodotti finali sono spermatozoi, che vengono rilasciati nel lume del tubulo seminifero e infine nella epididimo dove maturano ulteriormente.
Poiché il processo di spermatogenesi basa su condizioni ormonali e molecolari specialitesticoli, un sistema affidabile coltura in vitro per l'intero processo di spermatogenesi non è ancora stato sviluppato 2,3. Metodi di coltura sono stati sviluppati per la creazione di "cellule germinali primordiali come cellule" e, "le cellule spermatidi-come rotonde" aploidi da cellule staminali, ma questi metodi non sono ancora in grado di generare un gran numero di queste cellule e non riescono a produrre più tardi cellule spermatogenesi Tipi 4,5. Fortunatamente, i tipi cellulari spermatogenici differenze significative delle dimensioni, che consente una cella singola sospensione ottenuta da testicoli interi da separare con un gradiente liquido. Il metodo STA-PUT, ha dimostrato qui, usa un gradiente BSA lineare e semplice sedimentazione per separare le cellule spermatogenesi in base alle dimensioni e massa 6-9.
Il metodo STA-PUT ha diversi vantaggi rispetto agli altri due metodi più utilizzati per separare i tipi di cellule spermatogenesi: FACS e elutriazione 10-13. L'apparato STA-PUT richiede only diversi pezzi di cristalleria specializzati riuniti in una stanza fredda o grande frigorifero. Pertanto, è meno costoso rispetto all'utilizzo di un cell sorter o un elutriator. Il metodo STA-PUT produce una maggiore quantità di cellule per tipo di cellula e testicolo che possono essere ordinati per FACS in un arco di tempo comparabile, sebbene la purezza di ciascuna popolazione cellulare non è così elevata come quelli ottenuti con FACS 11. Cell sorting utilizzando biglie magnetiche (magnetico cell sorting attivato, MACS) è stato recentemente impiegato con successo per l'arricchimento di spermatogoni da una popolazione di cellule testicolari mista, ma è attualmente inadatto per separare spermatociti e spermatidi a causa della mancanza di conoscenza della superficie adeguatamente i marcatori 14. Un ulteriore vantaggio del metodo STA-PUT su FACS o MACS è la capacità di isolare cellule vitali adatto a cultura successiva perché, contrariamente alla maggior parte dei protocolli FACS, non richiede alcun DNA o altri tipi di colorazione. Per gli studi che richiedono lrendimenti arge di spermatogenesi tipi di cellule al ~ 90% di purezza, la STA-PUT è un metodo ideale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Coloro che studiano la spermatogenesi si basano su modelli animali per i campioni di cellule spermatogenesi, come un sistema di coltura cellulare affidabile non esiste ancora per generare tutti i tipi cellulari spermatogeniche 3. Anche se le cellule spermatogenesi sono prontamente raccolti dai testicoli intere, solo una popolazione mista risultati. Questo pone un problema per coloro che desiderano studiare specifici sottotipi di queste cellule, come le cellule meiotiche, spermatidi rotondi e spermatidi conden…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIH GM055360 per SLB e U54HD068157 di RGM. JMB è stata sostenuta dal T32 Genetica formazione di Grant presso l'Università della Pennsylvania (GM008216).
Materials
| BSA | Affymetrix/USB | 10857 100MG | Alternate can be used. |
| 0.5%, 2%, and 4% BSA solutions | Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively). | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| KREBS (10x) | 3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20 | Autoclave/filter and store at 4 °C for several months. | |
| KREBS (1x) | Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20. | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| Collagenase | Sigma | C9891-1G | |
| DNAse | Sigma | DNEP-5MG | |
| Trypsin | Sigma | T9201-1G | |
| DAPI | Preference of researcher | ||
| Triton-X100 | Preference of researcher | ||
| Formaldehyde (~37%) | Preference of researcher | ||
| TABLE 2: EQUIPMENT | |||
| Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Complete STA-PUT apparatus | ProScience Glass Shop | STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500) | Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers. |
| 10 μm mesh filter | Fisherbrand | 22363549 | |
| Mouse dissection tools | Preference of researcher | ||
| 14 ml round bottom fraction collection tubes with caps | Preference of researcher | ||
| Need approximately 100 tubes | |||
| Fraction collector | GE Healthcare Life Sciences | Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40 | Alternate can be used. |
| Microscope slides, cover glass | Preference of researcher | ||
| Light/Fluorescent Microscope | Preference of researcher | ||
Referencias
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