La separación de los tipos de células de espermatogénesis Usando STA-PUT Sedimentación Velocity

Summary

El método STA-PUT permite la separación de las diferentes poblaciones de células espermatogénica basado en el tamaño y la densidad.

Abstract

La espermatogénesis en mamíferos es un complejo proceso de diferenciación que se produce en varias etapas en los túbulos seminíferos de los testículos. Actualmente, no existe un sistema de cultivo celular fiable que permite la diferenciación espermatogénica in vitro, y la mayoría de los estudios biológicos de las células de espermatogénesis requiere la cosecha de tejidos de los modelos animales como el ratón y la rata. Debido a que el testículo contiene numerosos tipos de células – a la vez no espermatogénesis (de Leydig, de Sertoli, mieloides y células epiteliales) y de espermatogénesis (espermatogonias, espermatocitos, espermátidas redondas, condensación espermátidas y espermatozoides) – estudios de los mecanismos biológicos que intervienen en la espermatogénesis requerir el aislamiento y el enriquecimiento de estos diferentes tipos de células. El método STA-PUT permite la separación de una población heterogénea de células – en este caso, de los testículos – a través de un gradiente de BSA lineal. Tipos de células individuales sedimentan con diferente velocidad de sedimentación según la cetamaño LL, y fracciones enriquecidas para diferentes tipos de células pueden ser recogidos y utilizados en otros análisis. Mientras que el método STA-PUT no da lugar a fracciones altamente puras de tipos de células, por ejemplo, como se puede obtener con ciertos métodos de clasificación de células, proporciona un rendimiento mucho más alto del total de células en cada fracción
(~ 1 x 10 ⁸ células / tipo de células espermatogénica de una población a partir de 7-8 x 10 ⁸ células). Este método de alto rendimiento requiere sólo la cristalería especializada y se puede realizar en cualquier habitación fría o un refrigerador grande, por lo que es un método ideal para los laboratorios que tienen acceso limitado a los equipos especializados como un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) o elutriador.

Introduction

La espermatogénesis en mamíferos es un complejo proceso de diferenciación que se produce en varias etapas en los túbulos seminíferos de los testículos ^1. Brevemente, el vástago-como espermatogonias que residen cerca del epitelio de la brecha de los túbulos seminíferos y diferenciarse en espermatocitos, que luego se someten a divisiones meióticas. Después de la meiosis es completa, las células haploides resultantes, o espermátidas redondas, se someten a la espermiogénesis, un proceso de diferenciación que implica el derramamiento de citoplasma y compactación del núcleo. Espermátidas desarrollan gradualmente un flagelo y se someten a la elongación y la condensación del núcleo, produciendo alargándose y luego condensación espermátidas, respectivamente. Los productos finales son los espermatozoides, que son liberados en el lumen del túbulo seminífero y en última instancia en el epidídimo donde maduran más.

Debido a que el proceso de la espermatogénesis depende de las condiciones hormonales y moleculares especiales enlos testículos, un sistema fiable de cultivo in vitro para todo el proceso de la espermatogénesis todavía no se ha desarrollado ^2,3. Los métodos de cultivo se han desarrollado para la creación de "células similares a las células germinales primordiales" y "células-spermatid como redondas" haploides a partir de células madre, pero estos métodos no son capaces de generar un gran número de estas células y dejar de producir células espermatogénica más tarde tipos ^4,5. Afortunadamente, los tipos de células de espermatogénesis difieren significativamente en tamaño, lo que permite una suspensión de una sola célula obtenida de testículos enteros para ser separadas con un gradiente líquido. El método STA-PUT, se ha demostrado aquí, utiliza un gradiente lineal BSA y simple de sedimentación para separar las células de espermatogénesis en función del tamaño y la masa ^{de 6-9.}

El método STA-PUT tiene varias ventajas con respecto a los otros dos métodos más utilizados para separar los tipos de células de espermatogénesis: FACS y decantación ^10-13. El aparato STA-PUT requiere onlY varias piezas de cristalería especializada reunieron en una habitación fría o un refrigerador grande. Por lo tanto, es menos caro que el uso de un clasificador de células o un elutriador. El método STA-PUT produce mayores cantidades de células por tipo de célula y los testículos que puede ser ordenada por FACS en un plazo de tiempo similar, aunque la pureza de cada población celular no es tan alta como los obtenidos con FACS ^11. Clasificación de células utilizando perlas magnéticas (magnética clasificación de células activadas, MACS) se ha empleado recientemente con éxito para el enriquecimiento de las espermatogonias de una población de células testiculares mixto, pero en este momento no aptos para separar espermatocitos o espermátidas debido a la falta de conocimiento de la superficie apropiada marcadores ^14. Una ventaja adicional del método STA-PUT sobre FACS o MACS es la capacidad de aislar las células viables adecuadas para cultivo posterior, ya que, en contraste con la mayoría de los protocolos de FACS, que no requiere ningún ADN o otros tipos de tinción. Para los estudios que requieren lrendimientos arge de tipos de células de espermatogénesis en el ~ 90% de pureza, el STA-PUT es un método ideal.

Protocol

El protocolo de STA-PUT implica tres etapas: 1) Puesta en marcha de los aparatos y reactivos, 2) Preparación de la suspensión de células de testículos enteros, y 3) la carga de la célula, la sedimentación y la recogida de fracciones. Cuando es realizada por un equipo de dos investigadores, el protocolo de toma ocho horas en promedio. 1. Configuración del Aparato STA-PUT (Figura 1) *** Aparato de STA-PUT debe ser colocado en un refrigerador grande 4 ° C o un…

Representative Results

El resultado ideal el procedimiento STA-PUT es una separación bastante notable de las células de los testículos basado en el tamaño celular y la densidad. Mientras que las células aisladas de los testículos se sedimentan a través de la gradiente de BSA, varias bandas distintas de células pueden ser observados. Cualquier grupos de células tienden a hundirse hasta el fondo del gradiente y no contaminar las otras fracciones. Un poco más arriba el gradiente será el gran somáticas y células meióticas. Más arri…

Discussion

Los que estudian la espermatogénesis se basan en modelos animales para muestras de células de espermatogénesis, como sistema fiable de cultivo celular todavía no existe para generar todos los tipos celulares de espermatogénesis ^3. Aunque las células de espermatogénesis se recogen fácilmente de testículos enteros, sólo una población mixta resultante. Esto plantea un problema para aquellos que desean estudiar los subtipos específicos de estas células, como las células meióticas, espermátidas red…

Materials

BSA	Affymetrix/USB	10857 100MG	Alternate can be used.
0.5%, 2%, and 4% BSA solutions	Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively).		To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.
KREBS (10x)	3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20		Autoclave/filter and store at 4 °C for several months.
KREBS (1x)	Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20.		To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.
Collagenase	Sigma	C9891-1G
DNAse	Sigma	DNEP-5MG
Trypsin	Sigma	T9201-1G
DAPI	Preference of researcher
Triton-X100	Preference of researcher
Formaldehyde (~37%)	Preference of researcher
TABLE 2: EQUIPMENT
Equipment	Company	Catalog #	Comments
Complete STA-PUT apparatus	ProScience Glass Shop	STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500)	Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.
10 μm mesh filter	Fisherbrand	22363549
Mouse dissection tools	Preference of researcher
14 ml round bottom fraction collection tubes with caps	Preference of researcher
	Need approximately 100 tubes
Fraction collector	GE Healthcare Life Sciences	Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40	Alternate can be used.
Microscope slides, cover glass	Preference of researcher
Light/Fluorescent Microscope	Preference of researcher