Aquí se describe un ensayo in vivo mutagénesis por un pequeño número de células hematopoyéticas purificadas utilizando el modelo de ratón transgénico LacI. El gen LacI puede ser aislado para determinar la frecuencia, la ubicación y tipo de mutantes de ADN espontáneamente surgido o después de la exposición a genotoxinas.
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Artículo de método
La identificación de mutaciones del ADN en Purificada hematopoyéticas células madre / progenitoras
En este artículo
Resumen
Resumen
En los últimos años, se ha hecho evidente que la inestabilidad genómica está estrechamente relacionada con muchos trastornos del desarrollo, cáncer y envejecimiento. Dado que las células madre son responsables de asegurar la homeostasis del tejido y la reparación durante toda la vida, es razonable plantear la hipótesis de que la población de células madre es crítico para la preservación de la integridad genómica de tejidos. Por lo tanto, un interés significativo se ha producido en la evaluación del impacto de los factores endógenos y ambientales sobre la integridad genómica en las células madre y su progenie, con el objetivo de comprender la etiología de las enfermedades basados en células madre.
Ratones transgénicos LacI llevan un vector de fago λ recuperable que codifica el sistema reportero de LacI, en el que el gen LacI sirve como reportero de la mutación. El resultado de un gen mutado LacI es la producción de β-galactosidasa que escinde un sustrato cromogénico, convirtiéndose azul. El sistema indicador LacI es i llevado an todas las células, incluyendo las células madre / progenitoras y pueden ser fácilmente recuperados y utilizados para infectar posteriormente E. coli. Después de la incubación de E. infectada coli en agarosa que contiene el sustrato correcto, las placas se puede marcar; placas azules indican un gen mutante LacI, mientras que las placas claras puerto de tipo salvaje. La frecuencia de azul (entre claras) placas indica la frecuencia de mutantes en la población original de células se extrajo el ADN de. La secuenciación del gen mutante LacI mostrará la ubicación de las mutaciones en el gen y el tipo de mutación.
El modelo de ratón transgénico LacI es bien conocido por ser un ensayo in vivo de mutagénesis in. Por otra parte, los ratones y los reactivos para el ensayo están disponibles comercialmente. A continuación se describe en detalle la forma en este modelo puede ser adaptado para medir la frecuencia de mutantes de ADN que ocurre de forma espontánea en el tallo enriquecida con células Lin - IL7R - Sca-1 + cKit + + (LSCélulas K) y otras subpoblaciones del sistema hematopoyético.
Introducción
En la mayoría de los tejidos, las células diferenciadas tienen una vida útil limitada. Para mantener la integridad funcional,, las células madre específicas de tejido y de larga duración producen continuamente células progenitoras que a su vez dan lugar a las células completamente diferenciadas necesarios para la función de ese tejido particular. Las células madre también reponer su propio compartimento a través de un proceso llamado auto-renovación. Por lo tanto, las células madre son responsables de mantener la integridad funcional del tejido que residen pulg Por lo tanto, es imperativo que están equipadas con mecanismos robustos para detectar y potencialmente repa....
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Protocolo
Los leucocitos de LacI ratones transgénicos en un fondo C57BL / 6 no expresan Sca-1 (Figura 1). Por lo tanto, si Sca-1 es un marcador utilizado para la purificación de células, estos ratones tienen que ser cruzado con una cepa apropiada para ganar Sca-1 de expresión, en este protocolo de la F1 de un cruzamiento entre C57BL / 6 (B6) ratones normales y LacI (C57BL / 6) ratones transgénicos (LacI) se utiliza (Figura 1). De las poblaciones de células utilizadas en este protocolo, LSKs y CMP representan las poblaciones más pequeñas de la médula ósea. Con el fin de purificar al menos 2 x 10 5 de cada /....
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Resultados
El ensayo in vivo de la mutagénesis in mide un evento raro (UFP mutante) entre muchos eventos (todo UFP). Al realizar el ensayo con pequeño número de células, es posible que el resultado está influido considerablemente por los resultados falsos positivos y falsos negativos. Para solucionar este problema se realiza un experimento de dilución en serie con las células de la médula ósea no fraccionadas, cosechado de tres animales diferentes. Se midió la frecuencia de mutantes en la médula ósea de est.......
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Discusión
El ensayo in vivo de mutagénesis in descrito en el presente documento se basa en el modelo de ratón transgénico LacI originalmente generada por Kohler et al. 18 Este modelo utiliza un vector de fago λ que lleva un gen reportero lacI. Los dos sitios cos que flanquean el vector permite una recuperación relativamente simple y envasado posterior en partículas de fago infecciosas, utilizados para infectar E. coli. Una placa azul será generado por el fa.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a David R. Rodríguez, MA para el diseño gráfico y la fotografía en este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por fondos del GCCRI, el NIH / NIA (5R21AG033339) y el programa de subsidios para el Centro de Cáncer (P30CA054174) a la instalación de UTHSCSA de Citometría de Flujo y el Fondo para UTHSCSA avanzada Nucleic Acids Core.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| LacI ratones transgénicos | BioReliance Corporation | ||
| , que incluye el cóctel de ribonucleasa RNace-It | Agilent Technologies (Stratagene) | 720202 | |
| el extracto de empaque Transpack, incluidos los tubos transpack naranjas y azules y el SCS-8 E. coli | Agilent Technologies (Stratagene) | 200221 | |
| Estándares de tamaño de ADN – escalera lambda | Bio Rad | 170-3635 | |
| Membranas de tamaño de poro de 0,025 mM | Fisher (Millipore) | VSWP 025 00 | |
| 245 mm2 Placas de bioensayo (bandejas) | Fisher (Corning) | 07-200-600 | |
| Caldo NZY (polvo) | Fisher (Teknova) | N1144 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Agarosa | Fisher | E-3120-500 | |
| N,N-Dimetilformamida | Fisher | AC34843-5000 | |
| X-gal | Research Products Intl Corp (RPI) | B71800-10.0 | |
| Proteinasa K | Roche | 3-115-852 | |
| Extensor de PCR Taq Kit de polimerasa | 5 PRIME | 2200500 | |
| Kit de limpieza Agencourt AMPure XP | Beckman/Coulter | A63880 |
Referencias
- Maslov, A. Y., Vijg, J. Genome instability, cancer and aging. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (10), 963-969 (2009).
- Aguilera, A., Gomez-Gonzalez, B. Genome instability: a mechanistic view of its causes and consequences. Nat. Rev. Genet. 9 (3), 204-217 (2008).
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Reimpresiones y permisos
