정제 된 조혈 줄기 / 전구 세포에 DNA 돌연변이를 확인
Summary
여기서 우리는 LACI 유전자 변형 마우스 모델을 사용하여 정제 조혈 세포의 작은 숫자에 대한 생체 내 돌연변이 분석에 대해 설명합니다. LACI 유전자는 DNA의 돌연변이의 빈도, 위치 및 유형 자발적으로 일어 나 genotoxins에 노출 된 후를 결정하기 위해 분리 할 수있다.
Abstract
최근, 그것은 게놈 불안정성 단단히 많은 발달 장애, 암, 노화 관련되어 있다는 것이 명백되고있다. 줄기 세포가 생활 전반에 걸쳐 조직의 항상성 및 수리를 보장하는 책임이 있음을 감안할 때, 그것은 줄기 세포 인구는 조직의 게놈 무결성을 보존하는 중요한 가설하는 것이 합리적이다. 따라서, 상당한 관심이 줄기 세포 기초 질환의 병인을 이해하는 것을 목표로, 게놈 줄기 세포의 무결성 및 그들의 자손에서 내인성 및 환경 적 요인의 영향을 평가 생겨났다.
LACI 형질 전환 마우스는 LACI 유전자가 돌연변이 기자 역할을하는 LACI 기자 시스템을 암호화하는 복구 λ 파지 벡터를 수행합니다. 돌연변이 LACI 유전자의 결과는 클리브 파란색으로 돌려 발색 기질을, β-갈 락토시다 아제의 생산이다. LACI 기자 시스템은 수행의 i줄기 / 전구 세포를 포함하고 쉽게 복구이어서 E. 감염하는 데 사용할 수있는 모든 셀에 N, 대장균. 감염된 E. 배양 한 후 정확한 기판을 포함 아가로 오스에 대장균, 패 득점 수 있으며, 맑은 플라크가 야생형 항구 파란색으로 플라크는 돌연변이 LACI 유전자를 나타냅니다. 플라크 (클리어 중) 블루의 주파수는 DNA가 추출 된 원래 세포 인구의 돌연변이 빈도를 나타냅니다. 돌연변이 LACI 유전자를 시퀀싱 유전자의 돌연변이의 위치와 돌연변이의 종류를 표시합니다.
LACI 유전자 변형 마우스 모델에서 생체 내 돌연변이 분석으로 잘 확립되어있다. 또한, 분석을위한 마우스 및 시약은 시판되고있다. 여기에서 우리는이 모델이 자발적으로 줄기 세포가 풍부한 린의 DNA 돌연변이 발생 빈도를 측정하기 위해 적용 할 수있는 방법을 자세히 설명 – IL7R – 무서-1 + CKIT + + (LSK) 세포 및 조혈 시스템의 다른 부분 모집단.
Introduction
대부분의 조직에서 분화 된 세포는 제한된 수명이 있습니다. 기능적 무결성을 유지하기 위해, 수명이 긴, 조직 특이 적 줄기 세포는 지속적으로 차례로 특정 조직의 기능에 필요한 완전히 분화 된 세포에 야기 전구 세포를 생성한다. 줄기 세포는자가 재생 (self-renewal)이라는 과정을 통해 자신의 구획을 보충. 따라서, 줄기 세포들은 따라서 안으로있는 조직의 기능 무결성을 유지할 책임이 있으며, 그것은 그들이이 손상된 DNA를 감지하고 잠재적으로 복구하는 강력한 메커니즘을 갖추고 있습니다 것이 필수적입니다. 그렇지 않은 경우, 그들은 그들의 자손에 의해 상속 할 수있는 여러 게놈 (유해) 섭동을 획득 할 수있다. 줄기 세포는 유기체의 수명 동안 자신의 게놈을 안전 보호하는 방법을 이해하는 것은 중요한 문제이며, 게놈 불안정성은 암 (1,2 검토) 다른 연령과 관련된 질병에 링크 된 이유를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
<p cl엉덩이 = "jove_content는"> 줄기 세포 또는 초기 전구 세포 집단의 수준에서 조직의 게놈 무결성을 제어하는 / 세포의 죽음, 노화 또는 차별화를 통해 세포에 결함이 줄기 (또는 전구)를 제거하고, 하나 또는 효율적인 수리에 의해 달성 될 수있다 손상된 DNA. 최근의 연구는 이러한 희소 인구 3-6에서 직접 DNA 수리 및 특정 유형을 측정하는 것이 가능하다는 것을 증명하고있다. 그것은 예를 들어, 조혈 시스템, 이중 가닥의 DNA 나누기 (NHEJ), 후자는 낮은 충실도의 복구 프로세스 인 및 제조, 따라서 위험 증가에 합류 상동 재조합 (HR) 또는 비 동종 말까지 복구 할 수 있다는 것을 발견 오류. 모두가 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포) 4,5에 활용되고있다, 그러나, 마우스에 초기 조상 세포가 HR 4를 사용하는 반면이 조혈 모세포에서 주로 NHEJ 것 같다. 비슷한 관측 피부 6 줄기 세포를 위해 만들어졌습니다. 흥미롭게도, 인간의 조혈 모세포 HR에서,하지 NHEJ,이중 가닥 나누기 3에 대한 선택의 복구 메커니즘이 될 것으로 보인다. 두 종 사이의 기능적 차이가 실제 또는 단순히 기술이나 실험적인 차이를 나타내는 지 여부는두고 볼 일이다.손상된 DNA를 복구하는 줄기 세포의 레퍼토리는 기본 절단 수리 (BER), 뉴클레오티드 절단 수리 (NER)과 불일치 수리 (MMR) 등의 DNA 복구 메커니즘을 포함 할 가능성이있다. DNA 손상 이러한 유형의 NHEJ 또는 HR 복구 할 수 없습니다 MMR 수정 기본베이스 불일치 및 삽입 / 삭제 루프 동안 BER과 NER는 단일 가닥 DNA에서 하나 또는 여러 개의 기본 쌍의 병변을 수리 할 책임이 있습니다. 이 개념을 지원하는 것은 HSC 구획 7-9에서 이러한 경로와 이상 중 하나에 변화 사이의 링크를 보여주는 조혈 시스템뿐만 아니라, 골수이 형성 증후군 10-16,에 발생한 질병을 개발의 증가 위험에서 여러 연구하다HSC는 그 질병이 진행됨에 따라 (17)을 게놈 불안정성을 증가와 연관된다. 아직 바와 같이, 직접 조혈 모세포의 BER, NER 및 MMR의 측정은보고되지 않았다.
기계론 수준에서 티슈 무결성을 제어하는 다양한 프로세스를 해명 외에도, 이러한 프로세스 중 하나의 수차의 영향은 유 전적으로 대 정상에서 예를 들면, 테스트 될 수 있도록, 돌연변이 DNA의 정도를 측정 할 수있는 것이 필수적이다 설계 줄기 세포 또는 젊은 대 이전에. 그러나, 중요한 분석의 발전 때문에 조직 특이 적 줄기 세포의 소수와 "stemness"를 유지 배양 조건의 부족으로 인해 곤란하다. 또한, 이러한 분석은 환경 및 유전 적 조작을 수정할 수있는 있어야한다. 이러한 제한 사항 및 요구 사항에 대한 해결 방안이 구체적으로 DNA의 돌연변이를 검출 할 수 있도록 설계되어 마우스 모델을 사용하는 것입니다.
MUL돌연변이 검출을위한 tiple 형질 전환 마우스 모델이 개발되었다. 예를 들어, LACI 형질 전환 마우스 (18)는 LACI 유전자가 락 연산자의 억제를 인코딩하고 돌연변이 기자 역할을하는 LACI 기자 시스템을 암호화하는 복구 λ 파지 벡터를 수행합니다. LACI 유전자의 돌연변이에, 락 운영자가 활성화되고, β-갈 락토시다 아제가 생성됩니다. β-갈 락토시다 클리브이 파란색으로 변 발색 기질의 X-GAL (5 – 브로 모 -4 – 클로로 – e-인돌 릴-β-D-갈 락토 피 라노 사이드). LACI 벡터 측면의 COS 사이트는 람다 파지의 단백질과 E. 이후의 감염에 의해 쉽게 복구 할 수 있습니다 대장균. 감염된 E. 배양 한 후 대장균은 X-GAL 기판을 포함 아가 로스에 패 득점 할 수있다. 분명 플라크가 아닌 돌연변이를 정박하는 동안 블루 플라크, 락-I는 파지를 들고 추정 돌연변이가 포함되어 있습니다. 일 사이에 블루 플라크의 주파수 (전자 명확한 것)는 DNA가 추출 된 원래 세포 인구의 돌연변이 빈도를 나타냅니다. 더욱이 LACI 타겟을 호스팅 λ 파지가 용이 비교적 높은 처리량 분석 PCR 기법을 사용하여 시퀀싱 될 수있다. 여러 돌연변이 LACI 유전자를 시퀀싱 차례로 특정 DNA 수리 경로에서 가능한 결함 또는 특정 유전 독성 이벤트를 가리킬 수 변이 스펙트럼에 대한 중요한 정보를 공개합니다. LACI 형질 전환 시스템은 여러 실험실 19 일에 걸쳐 표준화되어 시약은 상업적으로 사용할 수 있습니다. LACI 시스템의 하나의 주요 단점은 대형 삭제 또는 재 배열을 감지하는 능력이 제한적이며, 따라서 중기 확산에 다른 방법, 예를 들어, 멀티 컬러 FISH이 부족을 보완하기 위해 사용되어야합니다.
LACI 마우스 모델의 λ 파지 벡터 내에 훨씬 작은 유전자 CII있어돌연변이 분석에 사용할 수 있습니다. 크기와 돌연변이가 선택 될 수 있다는 사실이 LACI 유전자 분석보다 덜 노동 집약적 저렴 세이 20 만든다. 발색 기질 22-25에 대한 표현형 반응을 발생 아미노산 잔기의 명확한 이해가되도록 그러나의 lacI 유전자가 더욱 광범위 돌연변이 (21)와 돌연변이 유전자의 감성 연구되고 잘 특징으로하고있다.
돌연변이 검출을위한 기타 마우스 모델 ΦX174 또는 LacZ를 트랜스 진의 사용을 포함한다. T → G : 원본과 ΦX174 형질 전환 마우스 모델, C의 복귀 돌연변이 시험 26 또는 염기쌍 치환의 스펙트럼의 검출, LACI 모델보다 적은 비용으로 시스템을 나타냅니다 수있는 앞으로 돌연변이 시험 27. 그러나, 앞으로 분석에서 돌연변이 화면이 사소한 돌연변이 사양이 아닙니다ΦX174 전이 유전자의 TRUM은 같은 LACI의 같은 특성이 잘되지 않습니다. LacZ를의 형질 전환 유전자를 운반 마우스 모델에서 LacZ를 돌연변이 기자는 E.을 이용하여 복구 갈락토스와 갈락토스 (28)를 포함하는 매체에 민감한 대장균 숙주 세포. 이 시스템의 단점은 LacZ를 타겟의 회복 또한 E. 결찰 및 일렉트로이어서 제한 효소 분해를 수반한다는 것이다 대장균함으로써 어려운 세포의 수가 적은 시스템에 적응하고, 호스팅합니다. 이 줄기 / 전구 세포 집단 작업을위한 절대적인 요건 (하나는 항상 더 많은 쥐를 시작할 수)은 아니지만 세포의 큰 숫자 (예를 들어 수백만 이상) 필요한 경우, 신속하게 허무하고 엄청난 비용이 될 것입니다. 민감한 돌연변이 리포터를 제공하면서 또한, LacZ를 중에서 비교적 큰 크기, 복잡하고 DNA 서열 분석 및 determ 더 비싸다돌연변이 스펙트럼의 ination. 이 모델의 주요 이점은 있지만, 그것의 큰 삽입 및 결실을 검출 할 수있는 능력뿐만 아니라, 염색체 재 배열이다.
LACI, ΦX174 및 LacZ를 트랜스 제닉 마우스 모델에서 모든 셀은 리포터 시스템을 운반하기 때문에, 이러한 마우스 모델 중 어느 한 그들은 확실하게 수납 할 수 있기 때문에, 줄기 및 전구 세포를 포함하여, 그 어떠한 세포 유형에 돌연변이를 측정하기 위해 사용될 수있다 충분한 숫자. 우리가 LACI 마우스 모델과 LACI 돌연변이 분석과 광범위한 경험을 가지고 있기 때문에, 우리는 조혈 줄기 및 전구 인구에서 돌연변이 분석에 대한이 시스템을 추구하기로 결정했다.
조혈 조직은 린의 극히 드문 인구로 식별 장기를 다시 채우기 줄기 세포를 포함하여 개별 구성 요소의 세포 표면 표현형의 측면에서 잘 특징 – IL7R <suP> – 무서-1 + CKIT + + (LSK) / Flk2 – CD150 + CD48 – 세포 29. . 그것은 DNA의 수리를 공부에 관해서 세포가 여전히 조혈 모세포에 좋은 대표하고 가장 원시적 인 헌신 골수 전구 (CMP) 집단에서 유의 한 차이 – Mohrin 등 4 LSK/Flk2의 약간 큰 인구는 것을 보여 주었다. 또한, 경우 HSC – 농후 LSK (FLK-2 + 및 FLK-2 -) – IL7R – 셀 린 비교 하였다 무서 -1 – CKIT + + (LS-K 전구 세포)에있는 상당한 차이가 여전히 있었다 덜 순수한 사이 NHEJ 능력 5, 세포 농축 LSK 인구 및 전구 세포를 줄기. 이 셀의 수는 매우 어렵습니다, 우리는 적어도 2 × 10 5 세포가이 돌연변이 분석에 일관 신뢰할 수있는 결과에 필요한 것을 발견하기 때문에 세포 – 우리의 연구에서 우리는 LSK (FLK-2 + 및 FLK-2) HSC 강화 사용CD150 + CD48 인구 또는 LSK/Flk2 – – 인구 (마우스, 비용과 실용성 측면에서) 하나가 LSK/Flk2을 정렬 할 때 얻었다. 원래 콜러 등. (18)에 의해 개발 된 하나에 기초하여이 프로토콜은, 자발적인 DNA 돌연변이 빈도가 차별화 골수 세포의 집단뿐만 아니라 분리되지 않은 골수 및 비장 세포 LSK 세포 판단되고 정의 될 수있는 방법을 상세하게 설명한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 명세서에 기재된 생체 내 돌연변이 유발 분석은 원래 콜러 등. 18이 모델의 lacI 리포터 유전자를 운반하는 λ 파지 벡터를 이용하여 생성 LACI 트랜스 제닉 마우스 모델에 기초한다. 벡터 전염성 파지 입자로 상대적으로 단순 복구 이후의 포장을 허용 측면에서는 두 COS 사이트, E.를 감염하는 데 사용 대장균. 블루 플라크는 파지에 감염된 E.에</em…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는이 원고에서 그래픽 디자인 및 사진 데이비드 R. 리 게스, MA에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 UTHSCSA 유동 세포 계측법 핵심 시설 UTHSCSA 고급 핵산 핵심 시설에 GCCRI, NIH / NIA (5R21AG033339) 및 암 센터 지원 그랜트 (P30CA054174)에서 자금에 의해 지원되었다.
Materials
| LacI transgenic mice | BioReliance Corporation | |
| RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail | Agilent Technologies (Stratagene) | 720202 |
| Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli | Agilent Technologies (Stratagene) | 200221 |
| DNA size standards – lambda ladder | Bio Rad | 170-3635 |
| 0.025 mM pore size membranes | Fisher (Millipore) | VSWP 025 00 |
| 245 mm2 bioassay dishes (trays) | Fisher (Corning) | 07-200-600 |
| NZY broth (powder) | Fisher (Teknova) | N1144 |
| Agar | Fisher | BP1423-500 |
| Agarose | Fisher | E-3120-500 |
| N, N-dimethylformamide | Fisher | AC34843-5000 |
| X-gal | Research Products Intl Corp (RPI) | B71800-10.0 |
| Proteinase K | Roche | 3-115-852 |
| PCR Extender Taq Polimerase kit | 5 PRIME | 2200500 |
| Agencourt AMPure XP cleanup kit | Beckman/coulter | A63880 |
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