Выделение и Th17 дифференцировки наивных CD4 Т-лимфоцитов
Summary
С эффекторных функций, отличных от других клеточных подмножеств Т, клетки Th17 были централизованно вовлечен в воспалительный аутоиммунными. Это пробирке протокол в Th17 дифференциация предоставляет средства для определения, является ли наивные CD4 + Т-лимфоциты могут дифференцироваться в клеток Th17, и для дальнейшего изучения их роли в аутоиммунных и ответа хозяина.
Abstract
Th17 клетки особым подмножество Т-клеток, как было обнаружено, продуцируют интерлейкин 17 (IL-17), и отличаются в зависимости от других клеточных подмножеств т с Th1, Th2 и регуляторных Т-клеток. Клетки Th17 появились в качестве центрального виновника в переусердствовать воспалительных иммунных реакций, связанных с многих аутоиммунных расстройств. В этом методе мы очистить Т-лимфоцитов из селезенки и лимфатических узлов мышей C57BL / 6, а также стимулировать очищенные CD4 + Т-клеток под контролем и Th17-индуцирующих средах. Th17-индуцирующей среда включает в себя стимуляцию в присутствии анти-CD3 и анти-CD28 антителами, IL-6 и TGF-β. После инкубации в течение по крайней мере 72 часов и на срок до пяти дней при 37 ° С, клетки затем анализировали на способность производить IL-17 через проточной цитометрии, КПЦР и ИФА. Th17 дифференцированными CD4 + CD25-Т-клетки могут быть использованы для дальнейшего выяснения роли, что Th17-клетки играют в возникновении и прогрессировании аутоиммунных и принимающей деFense. Кроме того, Th17 дифференциация CD4 + CD25-лимфоцитов из различных моделей мышей нокаутом / болезни может способствовать нашему пониманию клеточных судеб пластичности.
Introduction
CD4 + Т-лимфоциты (Т-клетки) играют важнейшую роль в иммунной системы опосредованного защиты от инфекционных микроорганизмов. С другой стороны, Т-клетки также тесно связана с наступлением и развитием аутоиммунных заболеваний, таких как диабет типа 1, системная красная волчанка и ревматоидный артрит. CD4 + Т-лимфоциты активируются путем сочетания Т-клеточного рецептора (TCR) взаимодействия с антигеном / главного комплекса гистосовместимости II (MHCII) молекул, а также взаимодействия рецепторов CD28 с B7.1/B7.2 лигандами 15. В дополнение к предоставлению TCR стимуляции и CD28 совместной стимуляции, антиген-представляющих клеток также обеспечивают цитокинов среды, которая определяет дифференциации состояние Т-лимфоцит, тем самым направляя реакцию Т-лимфоцитов в к данному антигену. Отдельное патоген / антиген-представляющих клеток взаимодействия создают различных средах цитокинов, которые исказить Т-лимфоцитов вниз различные пути, направленные на Элиной подсветкой инициирующего патогена. К сожалению, T-лимфоцитов эффекторные пути, первоначально направленные на искоренение вторжение болезнетворных микроорганизмов, может быть ошибочно направлена против самостоятельной тканей 15. Таким образом, более глубокое понимание состояния дифференцировки каждого отдельного CD4 + Т-клеток подмножество имеет решающее значение для нашего понимания того, как модулировать баланс между уничтожения патогенных и терпимости к себе.
В дополнение к Th1, Th2, и индуцируемой клеточной дифференцировки путей регуляторных Т, наивные Т-лимфоциты также может приводиться в действие цитокинов вниз по пути Th17. В то время как Th1 клеток боевых внутриклеточных патогенов, Th2 клетки устранить внеклеточных патогенов, и регуляторные Т-клетки (Tregs) минимизировать воспалительные реакции 1, 16; Th17-клетки играют важную роль в ликвидации внеклеточных бактерий и грибков. Th17 клетки обычно обозначается экспрессии специфических клонов фактора транскрипции RORγT и производства IL-17A, который способствует активации макрофагов и нейтрофилов 1, 7.
Th17 клетки были вовлечены в нескольких аутоиммунных заболеваний, а также связанные с ними модели на грызунах. Например, было продемонстрировано, что IL-23 (который необходим для поддержания фенотип Th17), но не IL-12, был центральной преступник в экспериментальном аутоиммунном энцефалите (ЭАЭ), модель болезни грызунов для MS. Это впоследствии было показано, что снижение производства IL-17 коррелирует с предотвращением EAE 2, 6, 17. Кроме того, клетки Th17 были связаны с другими аутоиммунными нарушениями, включая артрит и системная красная волчанка (СКВ) 10, 16. IL-23 дефицитных p19 – / – мышей было показано, имеют очень низкие количества клеток Th17, и устойчивы к развитию не только EAE, но и коллаген-индуцированного артрита, модели ревматоидного артрита 10, 18. Кроме того, мыши, получавшие нейтрализации IL-17A антитела кормеэ начало коллаген-индуцированного артрита были также установлено, что разрешение повреждения суставов 18. Следует отметить, что роль клеток Th17 в прогрессировании аутоиммунных заболеваний остается охарактеризовать как недавние исследования также показали защитную роль Th17-клеток в диабетом типа 1 9, 11 и воспаление кишечника 14. Эти исследования подтверждают важность Th17 дифференциации в аутоиммунными.
В пробирке дифференциации Th17 является необходимым методом в исследовании Т-клеток, потому что есть по крайней мере два трудных вопросов, которые требуют дальнейшего изучения: 1) Как именно ИЛ-6 регулируют баланс между Treg и Th17 дифференциации, и 2) каковы точные механизмы за Ил-17-индуцированной воспалительных заболеваний? Наша методика использует CD4 + CD25-Т-клеток из селезенки и лимфатических узлов C57BL / 6 мыши. Важно отметить, что хотя можно индуцировать дифференцировку Th17 с помощью нечистойнаселение, приобретая по крайней мере, 80% чистого CD4 + CD25-Т-клеток населения сводит на нет любое беспокойство загрязнения и обеспечивает более успешные результаты Th17 дифференциации. Для того чтобы достичь надлежащего дифференцировку Th17, CD4 + CD25-Т-клетки инкубировали в присутствии анти-CD3 и анти-CD28, которые обеспечивают сигналы активации, 1 и 2, соответственно, и IL-6, и TGF-β. Хотя сообщалось, что IL-23 только может быть использована для достижения Th17 дифференциацию, позднее было показано, что IL-23 является необходимым для стабильности клеточной популяции Th17, но IL-6 и TGF-β имеют важное значение для дифференциации Th17 3, 18, 19. Мышиные исследования показали, что рецептор IL-23 экспрессируется на CD4 + Т-клеток только после их стимулировали IL-6 и TGF-β 13, 18. Кроме того, клетки Th17 будет успешно развиваться в присутствии IL-23-антитела блокируют до тех пор, IL-6 и TGF-β присутствуют 18, 19. Таким образом, этот протокол пров Th17 дифференциацияIDES соответствующие условия для успешного вызвать Th17 дифференциации. Развитие лучшего понимания механизмов, лежащих Th17 дифференциации и IL-17 производства представить возможность для разработки более совершенных терапии, направленных на аутоиммунными нарушениями 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описали протокол для достижения в пробирке Th17 дифференциации. Изучение Th17 дифференциации важно, так как дифференциация Т-лимфоцитов в подгруппе Th17 имеет решающее значение для эффективной ликвидации человеческих патогенов 13. И наоборот, IL17 производство было связан?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично поддержана на NIH / NCATS клинических и трансляционных науки Awards в Университете Флориды TL1 TR000066 и UL1 TR000064, разнообразие дополнения от родителей Грант R01AI056152 из Национального института здравоохранения, гранта реагента BD Biosciences и университета Флориды.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Sterile Polyestrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | 60 mm x 15 mm |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Premium Microscope Slides, Frosted | Fisher Scientific | 12-544-3 | 3″ x 1″1 mm |
| 5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle | BD Biosciences | 309632 | |
| Corning 15 ml Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| Nylon 40 microns | Miami Aquaculture | Nylon 40/26 | |
| Microtest tissue culture plate 96 well U bottom | BD Biosciences | 35-3077 | |
| Corning Costar 24 well cell culture plates | Sigma-Aldrich | CL3524 | |
| Eppendorf Tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e | BD Biosciences | 553057 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | |
| Mouse IL-6 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8061-62 | |
| TGFbeta | R&D Systems | 240-B-002 | |
| Trypan blue solution 0.4 % | Sigma-Aldrich | 66H2364 | |
| Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 558107 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553035 | |
| PE Conjugated Anti-mouse CD25 | eBioscience | E01155-516 | |
| Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 | BD Biosciences | 560820 | |
| Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse | BD Biosciences | 51-2041AK (559311) | |
| MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| ABAM | Cellgro | 30-004-CI | |
| RPMI | Corning, Cellgro | 10-040-CM | |
| B 2-MercaptoEthanol | MP Biomedical | 194834 | Hazardous |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | |||
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | Hazardous |
| Brefeldin A (BFA) | MP Biomedicals | 159027 | |
| ELISA IL-17A Capture mAb | BD Biosciences | 555068 | |
| ELISA IL-17A Detection mAb | BD Biosciences | 555067 | |
| ELISA IL-17A Standard | eBioscience | 14-8171-80 | |
| IL-2 ELISA Kit | BD Biosciences | 555148 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Biosciences | 555214 | |
| Equipment | |||
| autoMACS Pro Cell Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge | ThermoScientific | ||
| Napco series 8000 WJ CO2 Incubator | ThermoScientific | ||
| PTC-200 Peltier Thermal Cycler | Biorad |
Referencias
- Chen, Z., Lin, F., et al. Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17. International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).
- Cua, D. J., Sherlock, J., et al. Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain. Nature. 421, 742-748 (2003).
- El-Behi, M., Rostami, A., et al. Current views on the roles of Th17 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalitis. J. Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
- Inaba, K., Kroide, S., et al. Properties of memory T lymphocytes isolated from the mixed leukocyte reaction. Proc Natl Acad Sci. 82, 7686-7690 (1985).
- L, I. v. a. n. o. v. F. r. u. t. o. s. R., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 16, 337-349 (2008).
- Jager, L. D., Dabelic, R., et al. The Kinase Inhibitory Region of SOCS-1 is Sufficient to Inhibit T helper-17 Function in Experimental Allergic Encephalomyelitis. J. Neuroimmunol. 232, 08-18 (2011).
- Kimura, A., Kishimoto, T. IL-6: regulator of Treg/Th17 balance. Eur. J. Immunol. 40, 1830-1835 (2010).
- Korn, T., Bettelli, E., et al. IL-17 and Th17 Cells. Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).
- Kriegel, M. A., Seflk, E., et al. Naturally transmitted segmented filamentous bacteria segregate with diabetes protection in nonobese diabetic mice. PNAS. 108, 11548-11553 (2011).
- Langrish, C. L., Chen, Y., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J. Exp. Med. 201, 233-240 (2005).
- Lau, K., Benitez, P., et al. Inhibition of type 1 diabetes by a Lactobacillus johnsonii mediated Th17 bias. J. Immunol. 186, 3538-3546 (2011).
- Lee, Y., Awasthi, A., et al. Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells. Nat Immunol. 13, 991-999 (2012).
- Litmann, D. R., Rudensky, A. Y. Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation. Cell. 140, 845-858 (2010).
- O’Connor, W., Kamanaka, M., et al. A protective function for interleukin 17A in T cell-mediated intestinal inflammation. Nat Immunol. 10, 603-609 (2009).
- Picca, C. C., Larkin, J., et al. Role of TCR specificity in CD4+CD25+ regulatory T cell selection. Immunol Rev. 212, 74-85 (2006).
- Shah, K., Lee, W. W., et al. Disregulated balance of Th17 and Th1 cells in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research & Therapy. 12, R53 (2010).
- Sospedra, M., Martin, R. Immunology of Multiple Sclerosis. Annu. Rev. Immunol. 23, 683-747 (2005).
- Stockringer, B., Veldhoen, M. Differentiation and function of Th17 T cells. Current Opinion in Immunology. 19, 281-286 (2007).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., et al. TGFβ in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24, 179-189 (2006).
- Zou, Y., Zhang, H., et al. Strain-dependent production of interleukin-17/interferon-γ and matrix remodeling-associated genes in experimental Candida albicans keratitis. Mol Vis. 18, 1215-1225 (2012).
