Aislamiento y diferenciación de Th17 Naïve linfocitos T CD4
Summary
Con funciones efectoras diferenciadas de otros subconjuntos de células T, las células Th17 se han implicado en el centro de la autoinmunidad inflamatoria. Este protocolo de diferenciación in vitro de Th17 es proporciona un medio para determinar si ingenuas linfocitos T CD4 + pueden diferenciarse en células Th17, y para examinar aún más su papel en la autoinmunidad y la respuesta del huésped.
Abstract
Células Th17 son un subconjunto distinto de las células T que se han encontrado para producir interleucina 17 (IL-17), y difieren en función de los otros subconjuntos de células T, incluyendo Th1, Th2, y células T reguladoras. Células Th17 han surgido como un culpable central en las respuestas inmunes inflamatorias exceso de celo asociados con muchos trastornos autoinmunes. En este método purificamos los linfocitos T del bazo y los ganglios linfáticos de ratones C57BL / 6, y estimular a las células T CD4 + purificadas bajo ambientes Th17 inductores de control y. El entorno de Th17-inducir incluye la estimulación en presencia de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, IL-6, y el TGF-β. Después de la incubación durante al menos 72 horas y hasta por cinco días a 37 ° C, las células se analizan posteriormente para la capacidad de producir IL-17 a través de la citometría de flujo, qPCR, y ELISA. Th17 diferenciado las células CD4 + CD25-T pueden ser utilizados para aclarar aún más el papel que juegan las células Th17 en el inicio y la progresión de la autoinmunidad y el anfitrión defensa. Por otra parte, Th17 diferenciación de CD4 + CD25 de los linfocitos de los modelos knockout / enfermedad murinos distintas puede contribuir a nuestra comprensión de la plasticidad del destino celular.
Introduction
Los linfocitos T CD4 + (células T) juegan un papel crítico en la defensa inmunitaria mediada por sistema contra microorganismos infecciosos. Por el contrario, las células T también están íntimamente asociados con la aparición y progresión de las enfermedades autoinmunes como la diabetes tipo 1, el lupus eritematoso sistémico, y artritis reumatoide. Linfocitos T CD4 + se activan a través de una combinación de receptor de células T (TCR) interacciones con el antígeno cognado / complejo mayor de histocompatibilidad II (CMHII) moléculas, y las interacciones de los receptores CD28 con B7.1/B7.2 ligandos 15. Además de la provisión de la estimulación de TCR y CD28 co-estimulación, las células presentadoras de antígeno también proporcionan un entorno de citoquinas, que determina el estado de diferenciación de los linfocitos T, dirigiendo de ese modo la respuesta del linfocito T al antígeno dado. Interacciones patógeno Distinct / célula presentadora de antígeno crean ambientes de citoquinas distintas, que sesgar los linfocitos T por distintas vías se centraron en la eliminación del patógeno desencadene. Desafortunadamente, T vías efectoras de los linfocitos, originalmente destinadas a eliminar los patógenos invasores, pueden ser erróneamente dirigidos contra los tejidos propios 15. Por lo tanto, una mejor comprensión del estado de diferenciación cada uno distinto del subconjunto de células T CD4 + es crucial para nuestra comprensión de cómo modular el equilibrio entre la eliminación de patógenos y la tolerancia a la libre.
Además de la Th1, Th2, y T reguladoras vías de diferenciación de células inducibles, linfocitos T vírgenes también pueden ser impulsados por citoquinas por la vía Th17. Mientras que las células Th1 patógenos intracelulares de combate, las células Th2 eliminar los patógenos extracelulares, y las células T reguladoras (Tregs) minimizan las respuestas inflamatorias 1, 16; células Th17 juegan un papel importante en la eliminación de bacterias extracelulares y hongos. Células Th17 se denotan generalmente por la expresión del factor de transcripción específico de linaje RORγT y producción de IL-17A, que promueve la activación de los macrófagos y neutrófilos 1, 7.
Células Th17 han sido implicados en varios trastornos autoinmunes, y sus modelos de roedores asociados. Por ejemplo, se ha demostrado que la IL-23 (que se requiere para mantener el fenotipo Th17), pero no de IL-12, era el culpable central en la encefalitis autoinmune experimental (EAE), el modelo de enfermedad de roedor para MS. Posteriormente, se ha demostrado que la reducción en la producción de IL-17 se correlacionan con la prevención de EAE 2, 6, 17. Por otra parte, las células Th17 se han asociado con otros trastornos autoinmunes como la artritis y el lupus eritematoso sistémico (LES) 10, 16. IL-23 p19 deficientes – / – ratones mostraron tener números muy bajos de células Th17, y son resistentes al desarrollo de la EAE no sólo, sino también la artritis inducida por colágeno-, un modelo para la artritis reumatoide 10, 18. Además, los ratones tratados con anticuerpos neutralizantes de IL-17A popaer Además, se constató la aparición de la artritis inducida por colágeno para tener la resolución del daño articular 18. Cabe señalar que el papel de las células Th17 en la progresión de la enfermedad autoinmune aún no se ha caracterizado como la investigación reciente también ha demostrado un papel protector de las células Th17 en la diabetes 9, 11 y la inflamación intestinal 14 Tipo 1. Estos estudios confirman la importancia de la diferenciación de Th17 en la autoinmunidad.
In vitro diferenciación Th17 es un método necesario en la investigación de células T debido a que hay al menos dos preguntas desconcertantes que requieren una mayor investigación: 1) ¿Cómo funciona exactamente la IL-6 regulan el equilibrio entre Treg y Th17 diferenciación, y 2) ¿Cuáles son los mecanismos exactos detrás de la IL-17 inducida-trastornos inflamatorios? Nuestro método emplea células CD4 + CD25-T a partir de los bazos y ganglios linfáticos de los C57BL / 6 de ratón. Es importante señalar que a pesar de que es posible inducir la diferenciación de Th17 utilizando un impuropoblación, la adquisición de al menos un 80% pura CD4 + población de células CD25-T niega cualquier preocupación de la contaminación y asegura más exitosos resultados de la diferenciación Th17. Con el fin de lograr la diferenciación de Th17 adecuada, las células CD4 + CD25-T se incuban en la presencia de anti-CD3 y anti-CD28, que proporcionan las señales de activación, 1 y 2, respectivamente, y la IL-6, y TGF-β. Aunque se ha informado de que la IL-23 solo se puede utilizar para lograr la diferenciación de Th17, más tarde se demostró que la IL-23 es necesaria para la estabilidad de la población de células Th17, pero TGF-β IL-6 y son esenciales para la diferenciación de Th17 3, 18, 19. Estudios murinos han demostrado que el receptor de IL-23 se expresa en células T CD4 + sólo después de que han sido estimuladas con IL-6 y TGF-β 13, 18. Además, las células Th17 desarrollarán con éxito en la presencia de anticuerpos IL-23 de bloqueo, siempre y cuando están presentes 18, 19 TGF-β IL-6 y. Como tal, esta diferenciación Th17 protocolo provIDES las condiciones apropiadas para inducir exitosamente Th17 diferenciación. Desarrollo de una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes de Th17 la diferenciación y la IL-17 de producción presentar la oportunidad para el desarrollo de mejores terapias dirigidas a los trastornos autoinmunes 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí hemos descrito el protocolo para lograr la diferenciación in vitro Th17. El estudio de la diferenciación de Th17 es importante, como la diferenciación de los linfocitos T en el subconjunto de Th17 es crítico para la eliminación efectiva de los patógenos humanos 13. A la inversa, la producción de IL17 se ha asociado con progresión de la enfermedad autoinmune 13. El método de diferenciación de Th17 es aplicable a muchos entornos de investigación, ya que se puede aplicar a nu…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado en parte por los premios NIH / NCATS clínica y traslacional Ciencia a la Universidad de Florida y TL1 TR000066 TR000064 UL1, un suplemento de la diversidad de los padres de Grant R01AI056152 del Instituto Nacional de Salud, una donación de reactivos BD Biosciences, y la Universidad de la Florida.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Sterile Polyestrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | 60 mm x 15 mm |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Premium Microscope Slides, Frosted | Fisher Scientific | 12-544-3 | 3″ x 1″1 mm |
| 5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle | BD Biosciences | 309632 | |
| Corning 15 ml Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| Nylon 40 microns | Miami Aquaculture | Nylon 40/26 | |
| Microtest tissue culture plate 96 well U bottom | BD Biosciences | 35-3077 | |
| Corning Costar 24 well cell culture plates | Sigma-Aldrich | CL3524 | |
| Eppendorf Tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e | BD Biosciences | 553057 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | |
| Mouse IL-6 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8061-62 | |
| TGFbeta | R&D Systems | 240-B-002 | |
| Trypan blue solution 0.4 % | Sigma-Aldrich | 66H2364 | |
| Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 558107 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553035 | |
| PE Conjugated Anti-mouse CD25 | eBioscience | E01155-516 | |
| Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 | BD Biosciences | 560820 | |
| Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse | BD Biosciences | 51-2041AK (559311) | |
| MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| ABAM | Cellgro | 30-004-CI | |
| RPMI | Corning, Cellgro | 10-040-CM | |
| B 2-MercaptoEthanol | MP Biomedical | 194834 | Hazardous |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | |||
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | Hazardous |
| Brefeldin A (BFA) | MP Biomedicals | 159027 | |
| ELISA IL-17A Capture mAb | BD Biosciences | 555068 | |
| ELISA IL-17A Detection mAb | BD Biosciences | 555067 | |
| ELISA IL-17A Standard | eBioscience | 14-8171-80 | |
| IL-2 ELISA Kit | BD Biosciences | 555148 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Biosciences | 555214 | |
| Equipment | |||
| autoMACS Pro Cell Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge | ThermoScientific | ||
| Napco series 8000 WJ CO2 Incubator | ThermoScientific | ||
| PTC-200 Peltier Thermal Cycler | Biorad |
Referencias
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