ومثلي الأشكال ورم أرومي نموذج الفأر القيود الحفاظ على الدماغ متني البدنية ومناسبة لحيوي داخلي ثنائي الفوتون المجهري
Summary
أنشأنا القشرية نموذج ورم أرومي دبقي مثلي في الفئران لحيوي داخلي المجهر ثنائي الفوتون الذي يلخص القيود الفيزيائية الحيوية عادة في اللعب أثناء نمو الورم. نافذة الزجاج المزمنة استبدال الجمجمة فوق الورم يمكن متابعة تطور الورم على مر الزمن من قبل اثنين من الفوتون المجهري.
Abstract
ورم أرومي دبقي الأشكال (GBM) هو الشكل الأكثر عدوانية من أورام الدماغ مع عدم وجود العلاجات العلاجية المتاحة حتى الآن.
نماذج الفئران من هذه الأمراض تعتمد على حقن تعليق الخلايا دبقي في الدماغ حمة التالية من شق الجافية-الأم. في حين أن الخلايا لديها ليتم حقنه سطحيا لتكون في متناول حيوي داخلي اثنين من الفوتون المجهري، فشل الحقن السطحي لألخص الظروف physiopathological. في الواقع، الهروب عن طريق الجهاز الأكثر حقن الخلايا السرطانية تصل إلى الفضاء خارج الجافية حيث التوسع السريع بشكل غير طبيعي في غياب القيود الميكانيكية من لحمة.
تحسينات لدينا تتكون ليس فقط في زرع الوزراء البريطانى كروي دبقي بدلا من حقن الخلايا دبقي تعليق في الطبقات السطحية للقشرة الدماغ ولكن أيضا في انسداد موقع الحقن من قبل عبر ربط هلام ديكستران نصفي حبة التي يتم لصقها على surrounقرع حمة ومختومة إلى الجافية-الأم مع فورية الغراء. تماما هذه التدابير فرض التوسع الفسيولوجية وتسلل الخلايا السرطانية داخل لحمة الدماغ. تم إغلاق حج القحف أخيرا مع نافذة زجاجية رسخ في الجمجمة للسماح التصوير المزمن على مدى أسابيع في غياب التنمية ندبا.
الاستفادة من الحيوانات المعدلة وراثيا الفلورسنت المطعمة مع الخلايا السرطانية الفلورسنت أظهرنا أن ديناميات التفاعلات التي تحدث بين الخلايا دبقي، الخلايا العصبية (مثل Thy1-CFP الفئران) والأوعية الدموية (التي أبرزتها حقنة في الوريد من صبغة الفلورسنت) يمكن تصور من قبل حيوي داخلي المجهر ثنائي الفوتون أثناء تطور المرض.
إمكانية وجود ورم في صورة قرار المجهرية في بيئة الدماغي للخطر الحد الأدنى يمثل تحسنا من النماذج الحالية الحيوان الخليج للحاسبات الآلية التي ينبغي أن تستفيد مجال علم الأورام العصبية واختبار المخدرات. </p>
Introduction
يظهر ورم أرومي دبقي الأشكال باعتبارها الشكل الأكثر عدوانية من ورم في المخ في البالغين مع بقاء متوسط 12 شهرا و 5 سنوات معدل البقاء على قيد الحياة من 5٪. يعتمد التدبير العلاجي السريري على الجراحة والعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي غالبا ما تستخدم في تركيبة. ومع ذلك، فإن آثار هذه العلاجات الملطفة تبقى 1-3.
حتى الآن، فإن معظم الدراسات العصبية الأورام تعتمد على التقنيات التي هي الوحيدة القادرة على تقديم وجهة نظر ثابتة والتي أجريت على الأفواج الكبيرة من الورم الحيوانات تحمل التضحية في مختلف نقاط الوقت (انظر على سبيل المثال 4،5). التطورات الأخيرة في طرق المتابعة على أساس intravital التصوير يسمح بدراسة نمو دبقي والتفاعلات بين الخلايا السرطانية والمكروية المرضية في جسم المريض على نفس الحيوان مع مرور الوقت. هذا يفتح الطريق أمام قطعة حصرية من المعلومات التي كانت غير قابلة للتحقيق حتى الان 6. الحيوانات المعدلة وراثيا معربا به نيون في خلايا الفائدة قد يكون استخدامد لدراسة التفاعلات محددة بين الخلايا السرطانية والخلايا العصبية على سبيل المثال في هذه الورقة.
على مدى العقد الماضي، حيوي داخلي اثنين من الفوتون المجهري 7 أصبح معيار الذهب في الدراسات العصبية الأورام الأساسية والتجارب قبل السريرية 8،9 لقدرته على أداء الملاحظة حيوي داخلي عميق من مخ الفأر (> 500 ميكرون تحت الجافية-ماتر) مع قرار المكانية المصغر 10. باستخدام حيوي داخلي ثنائي الفوتون المجهري مع النماذج الحيوانية orthotopical مزروع مع نافذة الجمجمة المزمن 11، فمن الممكن لمتابعة تطور الورم على مر الزمن على نفس الماوس 9،12.
واحدة من العوائق الرئيسية من هذه النماذج الحيوانية نشرت سابقا هو بيد أنها لا تحاكي القيود المادية التي تحكم نمو الورم كما هو لا مختومة الجافية-الأم بعد حقن تعليق خلية 9،13،14. الخلايا دبقي قد تسرب فيالفضاء الجافية تحويل نموذج دبقي مثلي في احد منتبذ.
نموذج حيواني المقدمة هنا يتمثل في حقن كروي الخلايا دبقي الفلورسنت في القشرة المخية على عمق 200 ميكرون تليها ختم الجافية-الأم مع ربط عبر ديكستران هلام نصفي حبة والغراء histo متوافقة . ثم يتم تقييد نمو الورم إلى الدماغ حمة التي تحافظ على القيود المادية المرضية في جسم المريض. نافذة الزجاج المزمنة مزروع فوق الورم يسمح الوصول السهل البصرية لحيوي داخلي اثنين من الفوتون المجهري. استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا معربا به نيون في خلايا الفائدة فمن الممكن لإجراء متابعة نمو دبقي مع مرور الوقت ودراسة تفاعلها مع المكروية لها (هنا مع الخلايا العصبية والأوعية الدموية مع أبرز dextrans الفلورسنت).
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا النهج يتيح استخدام أساليب التصوير الضوئي لرصد خلال الأيام والأسابيع نمو دبقي وهو مزروع orthotopically. في وقت لاحق يمكن أن تخضع لنفس الحيوان تقريبا أي طريقة تصوير الدماغ خلال علم الأمراض؛ بعد إعداد محددة اثنين من الفوتون المجهري يوفر فرصة فريدة لتحقيق قرار التحت خلوية …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفين أشكر بحرارة الدكتور KK Fenrich الدكتور MC. أمووريوإكس، P. ويبر وA. JAOUEN لإجراء مناقشات مفيدة؛ M. حسين، C. منير، M. متولي، S. Bensemmane، J. Bonnardel، وموظفي مرفق الحيوانية في IBDML وموظفي منصة التصوير PicSIL في IBDML للدعم التقني. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للسرطان (إنكا-DGOS-INSERM6038) إلى GR، الوكالة الوطنية دي لا بحوث (ANR JCJC PathoVisu3Dyn)، الاتحاد من أجل لا بحوث سور لو Cerveau (FRC) لFD، من خلال المنح الدراسية من الاتحاد دي لا بحوث ميديكال وCancéropole PACA إلى CR.
Materials
| Drill | Dremel (Germany) | 398 | any high quality surgical bone drill would suffice |
| Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr) | World Precision Instruments (USA) | 501860 (#1/4) | also sold by Harvard Apparatus |
| Tissue scissors | World Precision Instruments (USA) | 14395 | |
| Dumont tweezers M5S | World Precision Instruments (USA) | 501764 | |
| Dental cement | GACD (USA) | 12-565 & 12-568 | |
| Cyanoacrylate | Eleco-EFD (France) | Cyanolit 201 | |
| Glass capillaries without filament | Clark Electromedical Instruments (UK) | GC100-15 | |
| Microliter syringe (25 µl) | Hamilton (USA) | 702 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments (USA) | Kite-R | |
| T derivation (3-way stopcock – Luer lock) | World Precision Instruments (USA) | 14035-10 | |
| Stereotactic frame (mouse adaptor) | World Precision Instruments (USA) | 502063 | |
| Glass coverslips | Warner Instruments (USA) | CS-5R (64-0700) | |
| Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads | Available from various suppliers including Sigma (Germany) | ||
| Eye ointment | TVM (France) | Ocry-gel | |
| Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII (Germany) | also sold by other companies | |
| Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP (Germany) | also sold by other companies (Nikon, …) | |
| Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | also sold by other companies |
Referencias
- DeAngelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344, 114-123 (2001).
- Ricard, D., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 379, 1984-1996 (2012).
- Prados, M. D., et al. Phase III randomized study of radiotherapy plus procarbazine, lomustine, and vincristine with or without BUdR for treatment of anaplastic astrocytoma: final report of RTOG 9404. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 1147-1152 (2004).
- Piao, Y., et al. Glioblastoma resistance to anti-VEGF therapy is associated with myeloid cell infiltration, stem cell accumulation, and a mesenchymal phenotype. Neuro Oncol. 14, 1379-1392 (2012).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, 472-485 (2011).
- Studwell, A. J., Kotton, D. N. A shift from cell cultures to creatures: in vivo imaging of small animals in experimental regenerative medicine. Mol Ther. 19, 1933-1941 (2011).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243, 221-226 (2011).
- Ricard, C., et al. Short-term effects of synchrotron irradiation on vasculature and tissue in healthy mouse brain. J Synchrotron Radiat. 16, 477-483 (2009).
- von Baumgarten, L., et al. Bevacizumab has differential and dose-dependent effects on glioma blood vessels and tumor cells. Clin Cancer Res. 17, 6192-6205 (2011).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , 680 (2008).
- Lathia, J. D., et al. Direct in vivo evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6, (2011).
- Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
- Winkler, F., et al. Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis. Glia. 57, 1306-1315 (2009).
- Newcomb, E., Zagzag, D., Van Meir, E. G. Ch. 12. CNS Cancer, Cancer Drug Discovery and Development. , 227-241 (2009).
- Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
